基于翅脉的图像数字化分析进行嗜尸性蝇类种类鉴定

尚艳杰，潘鹏亮，李香蓉，李轲，林江，郭亚东

1.中南大学基础医学院法医系，湖南 长沙 410013；2.信阳农林学院，河南 信阳464000

法医昆虫学是节肢动物科学和法医学在广泛领域结合并相互影响的一门新型边缘交叉性学科，在腐败尸体死亡时间（postmortem interval，PMI）推断方面体现出特殊优势[1-2]。尸体上最常发现的昆虫是双翅目（Diptera）中的蝇类，尤其是丽蝇科（Calliphoridae）、麻蝇科（Sarcophagidae）和蝇科（Muscidae）在实践工作及科学研究中被法医昆虫学家广泛关注[3-4]。由于不同嗜尸性蝇类生长发育规律差异较大，因此准确、快速的种类鉴定是利用嗜尸性蝇类进行PMI 推断的关键步骤[5-6]。在法医昆虫学实践中，嗜尸性蝇类种类鉴定主要采用形态学和DNA 分析的方法，但是由于形态学鉴定要点极为复杂多变，DNA 种类鉴定费用昂贵，且一些近缘种难以利用DNA 条形码技术区分开等问题阻碍了其在法医学实践中的应用[7]。近年来，除了形态学或DNA 鉴定外，基于昆虫形态特征的数字化分析，由于简单、低成本和快速等特点，已经逐渐被应用于昆虫的种类鉴定、性别二态性、物种的地理变异等研究[8-9]。昆虫的形态特征分析包括使用一系列的参考点或标志，对任何身体结构进行形态特征比较，去除不相关的信息，如样本的位置和方向，并仅考虑其形态特征变化[10]。在双翅目昆虫中，翅脉的交叉点通常被用作这种分析方法的标志点。其中，应用翅脉的图像数字化分析进行种类鉴定的准确性和可靠性已经在一些双翅目昆虫中得到了研究和证实[11-12]。

因此，本研究用腐肉野外随机诱捕了7 种常见的嗜尸性蝇类作为研究对象，利用基于翅脉的图像数字化分析对这几种常见的嗜尸性蝇类进行种类鉴定，以评估这种方法的可靠性。同时由于雌性嗜尸性蝇类在法医学现场更常见而鉴别更难，本研究还单独利用翅脉的图像数字化分析对这7 种嗜尸性蝇类的雌性成虫进行种类鉴定评估，期望为法医昆虫学中常见嗜尸性蝇类快速、准确的种类鉴定提供一种新的思路。

1 材料与方法

1.1 嗜尸性蝇类样本的收集

2019 年9 月，在长沙市岳麓山附近的草地上放置猪肺等腐肉，环境温度21 ℃～32 ℃，湿度70%～85%，用捕蝇网随机抓捕7 种嗜尸性蝇类，分别为棕尾别麻蝇Sarcophaga peregrina（Robineau-Desvoidy 1830）、绯角亚麻蝇Parasarcophaga ruficornis（Fabricius，1794）、酱亚麻蝇Sarcophaga dux（Thomson，1868）、拟东方辛麻蝇Seniorwhitea reciproca（Walker，1856）、红尾粪麻蝇Bercaea cruentata（Meigen，1826）、裸芒综蝇Synthe⁃siomysia nudiseta（Wulp，1883）、巨尾阿丽蝇Aldrichi⁃na grahami（Aldrich，1930）（表1）。上述采集到的嗜尸性蝇类首先由我国法医昆虫学专家陈禄仕教授在野外初步观察分类，然后在实验室用体视显微镜（Moticam pro 285，北京瑞科中仪科技有限公司）根据传统的形态学分类法进行种类鉴定，再带回法医昆虫学实验室分别进行传代饲养。在饲养过程中，7 种嗜尸性蝇类共收集226 只用于后续的研究，每个蝇类物种收集的雌雄样本数见表1。

表1 物种信息Tab.1 The information of fly specimens

1.2 翅脉的图像数字化处理与数据采集

根据SONTIGUN 等[13]的方法，用细镊子小心地取下每只苍蝇完整无损伤的右翅，用于后续翅脉的形态特征分析。利用Epson Perfection V370 Photo 扫描仪［爱普生（中国）有限公司］的内置透扫适配器对每一个翅膀进行扫描，分辨率设置为1 200 dpi。扫描出的翅膀图像用tpsUtil V.1.78 软件[14]转换为tps 文件以减少因标记点位置导致的误差。选取7 种蝇类右翅上共有的17 个翅脉交叉点作为分析的标志点，使用tpsDig2 V.2.31 软件[14]对标志点进行数字化处理，将翅脉上的标志点转换为方便计算的数字化坐标。每个翅膀由同一人间隔24 h 用软件数字化处理3 次，然后取3 次数字化坐标的平均值作为用于统计分析的坐标值，以减少测量所带来的误差。7 种嗜尸性蝇类的右翅形状特征和17 个标志点见图1。每只用于实验的蝇类被放入带有75%乙醇溶液的微量离心管中单独编号保存于本实验室标本库。

图1 7种嗜尸性蝇类的右翅形状特征和17个翅脉交叉的标志点Fig.1 Morphological characteristics of the right wing of 7 sarcosaprophagous flies and the 17 intersections of wing veins as the landmarks

图像数字化处理后的tps 文件被加载到MorphoJ V1.06 软件[15]上进行数据分析，然后使用Procrustes 拟合函数对所有样本的原始坐标进行叠加处理，以消除因坐标的比例、位置和方向不同而产生的误差。经Procrustes 分析后得到Procrustes 坐标和质心大小，用于对翅脉异速生长效应的评估。

1.3 异速生长影响分析

由于翅膀的大小会影响其形状变化（异速生长效应），因此，在进行形状变化分析之前，对异速生长效应的评估是重要的一步[13]。选择MorphoJ V1.06 软件中的“Permutation Test”（置换检验，参数为10 000 次，以质心大小为自变量，以Procrustes 坐标为因变量）在种间和种内分别进行回归分析，以评估异速生长效应的影响，检验水准α=0.05。如果这种异速生长的影响具有统计学意义，使用回归分析的残差去除异速生长的影响，分析翅膀形状的差异变化[8]。此外，异速生长对性别二态性的影响通过对同一物种不同性别的质心大小和Procrustes 坐标进行回归分析来检验。

1.4 翅脉形状的图像数字化分析

使用MorphoJ V1.06 软件中基于马氏距离（Maha⁃lanobis distances）的典型变量分析（canonical variate analysis，CVA）对各蝇类之间的翅脉形状差异进行分析。同时利用该软件中的置换检验（参数设置为10 000 次）对翅脉的形状变化在不同蝇种之间的差异进行回归分析，检验水准α=0.05。使用判别函数分析（discriminant function analysis，DFA）中的交叉验证评估基于马氏距离进行物种分类的可靠性和准确性。利用CVA 方法和交叉验证对7 种嗜尸性蝇类雌性成虫的区分可靠性进行评估。

2 结果

2.1 异速生长分析结果

7种嗜尸性蝇类种内的异速生长分析（表2）表明，酱亚麻蝇、红尾粪麻蝇、巨尾阿丽蝇以及裸芒综蝇4个蝇种异速生长对种内翅膀形状变化的影响具有统计学意义（P<0.05）。此外，7 种嗜尸性蝇类种内性别之间的异速生长分析（表2）表明，在酱亚麻蝇、巨尾阿丽蝇以及裸芒综蝇3 个蝇种中发现异速生长对性别之间翅膀形状变化的影响具有统计学意义（P<0.05）。

表2 7种蝇类物种内部和性别之间异速生长对翅膀形状变化的影响Tab.2 The effects of allometric on shape variation of wings in each fly species and between sexes of each species

2.2 物种间翅脉的图像数字化分析结果

在整体物种鉴定的水平上，CVA 中7 种嗜尸性蝇类种间翅膀的形状变化结果显示，前两个典型变量（canonical variate，CV）（变量1 和变量2）占据了翅脉形状总变异的82.9%（CV1 为70.3%，CV2 为12.6%）（图2）。CV1 和CV2 的散点图显示，除了裸芒综蝇与其他6 个物种明显分开外，其他物种之间有较多的重叠区域，尤其是绯角亚麻蝇、酱亚麻蝇、拟东方辛麻蝇、红尾粪麻蝇4 种麻蝇。变换网格图（图3）显示，2、3、6、11、12、13、17 标志点在CV1 轴可见明显的形状变化，2、3、10、11、12、13、14 标志点在CV2 轴可见明显的形状变化。7 个物种两两之间的马氏距离（表3）显示，马氏距离从7.7（红尾粪麻蝇和酱亚麻蝇）到34.2（裸芒综蝇和酱亚麻蝇）。置换检验的结果显示，在7种嗜尸性蝇类物种间，翅脉的形状变化差异具有统计学意义（P<0.05）。交叉验证（表4）表明，利用翅脉形状的数字化分析可以区分这7 种常见的嗜尸性蝇类，种类判别准确率为81.2%～100.0%。

表3 7种嗜尸性蝇类之间CVA分析得出的马氏距离Tab.3 The Mahalanobis distances among 7 sarcosaprophagous fly species based on CVA

表4 7种嗜尸性蝇类种间交叉验证的准确率Tab.4 The accuracy of cross-validation test on 7 sarcosaprophagous fly species （%）

图2 7种嗜尸性蝇类种间典型变量分析结果散点图Fig.2 Scatter plot of canonical variate analysis results of 7 sarcosaprophagous fly species

图3 7种嗜尸性蝇类17个翅脉标志点变换网格图Fig.3 Transformation grids diagram of 17 wing intersections landmarks on 7 sarcosaprophagous fly species

2.3 雌性物种间翅脉形状的数字化分析结果

在雌性物种鉴定的水平上，7 种嗜尸性蝇类雌性种间翅膀的形状变化CVA 结果显示，前两个CVA 占据了翅脉形状总变异的84.1%（CV1 为70.0%，CV2 为14.1%）。CV1 和CV2 的散点图显示，除了裸芒综蝇和巨尾阿丽蝇与其他蝇类物种明显分开外，5 个麻蝇物种之间有较多的重叠区域。变换网格图（图5）显示，2、3、6、11、12、17 标志点沿CV1 轴的形状变化明显，2、3、4、6、11、12、13、14 标志点沿CV2 轴的形状变化最明显。由7 个蝇类物种雌性翅膀之间的成对比较中获得的马氏距离（表5）显示，马氏距离从8.1（拟东方辛麻蝇和酱亚麻蝇）到254.4（裸芒综蝇和酱亚麻蝇）。置换检验显示，翅脉的形状变化在7 种嗜尸性蝇类雌性种间的差异具有统计学意义（P<0.05）。交叉验证（表6）表明，利用翅脉形状的数字化分析可以区分这7 种常见的雌性嗜尸性蝇类，种类判别准确率为75.0%～100.0%。

图4 7种嗜尸性蝇类雌性种间典型变量分析结果散点图Fig.4 Scatter plot of canonical variate analysis results of 7 sarcosaprophagous female fly species

图5 7种雌性嗜尸性蝇类17个翅膀标志点变换网格图Fig.5 Transformation grids diagram of 17 wing intersections landmarks on 7 sarcosaprophagous female fly species

表5 7种嗜尸性蝇类雌性之间CVA分析得出的马氏距离Tab.5 The Mahalanobis distances among 7 sarcosaprophagous female fly species based on CVA

表6 7种嗜尸性蝇类雌性种间交叉验证的准确率Tab.6 The accuracy of cross-validation test on 7 sarcosaprophagous female fly species （%）

3 讨论

准确、快速的种类鉴定是利用嗜尸性蝇类进行PMI推断的关键步骤之一。近年来，翅脉形状特征的图像数字化分析已成为鉴别一些双翅目昆虫的一种简便、可靠的方法，通过对较为完整的昆虫翅膀进行图像训练和数字化特征分析，能获得较为准确的种类鉴定结果[10-11，15-16]。然而，在形态测量学研究中，对异速生长效应的估计是任何形态特征分析中必不可少的一步，有研究已证明异速生长效应可能会对物种分类的准确性产生影响[13，17-18]。本研究发现，酱亚麻蝇、红尾粪麻蝇、巨尾阿丽蝇以及裸芒综蝇4 个蝇种异速生长对种内翅膀形状变化的影响具有统计学意义，酱亚麻蝇、巨尾阿丽蝇以及裸芒综蝇3 个蝇种异速生长对种内性别之间翅膀形状变化的影响具有统计学意义。

在本研究中，CVA 和交叉判别实验的结果都表明，利用翅脉的图像数字化分析可以区分这7 种常见的嗜尸性蝇类，与既往应用昆虫翅脉的形态特征进行种类鉴定研究的结果[11-12]相似，7 种嗜尸性蝇类物种间的交叉验证得到了较高的种类鉴定准确率（81.2%～100.0%）。此外，有研究结果[19]表明，在腐败的尸体上，雌性嗜尸性蝇类比雄性的数量更多，在腐败尸体现场，捕获雌性嗜尸性蝇类的概率较大，因此，准确鉴别雌性嗜尸性蝇类的种类对于法医昆虫学来说是非常重要的。然而，大多数成年雌性嗜尸性蝇类在外观上极为相似，传统的形态学鉴定一般也是基于雄性外部生殖器的形态进行鉴定，雌性的鉴别要点比较少见，使得雌性嗜尸性蝇类的种类鉴定成了一个较为困难的问题。在本研究中，单独利用翅脉形状的数字化分析对这7 种嗜尸性蝇类的雌性成虫进行了种类鉴定评估，发现利用翅脉的形状变化可以区分这7 种雌性嗜尸性蝇类，种类判别准确率为75.0%～100.0%。因此，基于翅脉形状的图像数字化分析可以对这7 种常见嗜尸性蝇类进行物种鉴定，具有简便、快捷、低成本等优势。然而，利用翅膀形状变化分析的方法进行昆虫种类鉴定时应注意，该方法目前仍然处于理论研究中，其可靠性和准确性还需要在更多物种和样本中进行验证。因此，为了更准确地鉴定物种，对于一些判别准确率低于90%的麻蝇种类鉴定，建议将翅膀形状变化分析方法与传统的形态学鉴定或DNA 鉴定联合使用以提高种类鉴定的准确率[13]。

综上所述，本研究通过对7 种常见嗜尸性蝇类种间以及雌性种间翅脉图像进行数字化处理和形状特征分析，发现基于翅脉图像的数字化分析可以用于这7 种常见嗜尸性蝇类种间以及雌性种间的种类鉴别。基于翅脉图像的数字化分析可以成为一种嗜尸性蝇类种类鉴定研究的新思路，在未来的研究中，将增加样本量，使用翅脉图像的数字化分析方法对更多的嗜尸性蝇类物种进行种类鉴别研究，为实现更为快速、简单的嗜尸性蝇类种类鉴定，提高其在实际案件中的应用奠定基础。