miR-625在胃癌患者血清中的表达及与胃蛋白酶原水平的相关性*

王 伟，郑水平，罗 琴

（荆门市中医医院 1.脾胃一科；2.脾肺病科，荆门 448000）

胃癌是一种起源于胃黏膜细胞的常见恶性肿瘤，发病率男性高于女性，且多发于中老年人群。由于人们不良生活习惯和生活环境影响，近年来胃癌发病率呈逐年升高趋势[1]。胃癌早期症状与其他胃部疾病相似，不具有典型特征，导致大部分胃癌在早期难以被诊断而进展至中晚期，中晚期胃癌患者生存率极低[2]。探寻胃癌生物标志物、提高早期诊出率是改善患者预后重要手段。研究表明，胃蛋白酶原（Pepsinogen，PG）对慢性胃炎患者胃黏膜损伤具有一定诊断价值[3]。血清胃蛋白酶原Ⅰ（PepsinogenⅠ，PGⅠ）、胃蛋白酶原Ⅱ（Pepsinogen Ⅱ，PGⅡ）及胃蛋白酶原Ⅰ/胃蛋白酶原Ⅱ（Pepsinogen rate，PGR）可用于胃癌大规模筛查，提高胃癌早期诊断率[4]。Zhang 等[5]研究发现，人脑胶质瘤组织和细胞中miR-625表达水平低于正常脑组织和人星形胶质细胞，其可能通过影响癌细胞周期和凋亡发挥抑癌作用，或许可作为胶质瘤诊断靶点和预后标志物。胃癌组织中miR-625 表达水平及其与PG 相关性如何目前少见相关报道，本研究旨在分析miR-625 与PGⅠ、PGⅡ、PGR 水平相关性及其在胃癌中的诊断价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2016 年2 月至2019 年2 月荆门市中医医院收治的246例胃部疾病患者作为研究对象。经胃镜检查和病理切片检查，根据中华医学会消化病学分会《中国慢性胃炎共识意见》[6]和国际抗癌联盟TNM分期第7版[7]，将入组患者分为胃癌组84例，慢性萎缩性胃炎组73例，慢性非萎缩性胃炎组89例。胃癌组中男49 例，女35 例，年龄35～79 岁，平均（63.24±18.37）岁；慢性萎缩性胃炎组中男40 例，女33 例，年龄32～75 岁，平均（61.59±16.13）岁；慢性非萎缩性胃炎组中男52例，女37例，年龄34～76岁，平均（62.05±16.68）岁。纳入标准：①所有入组患者均行胃镜检查和病理切片检查，确诊为相应疾病。②临床及病理资料完整。③近1个月内未服用抗生素类、质子泵抑制剂类药物。排除标准：①合并患有其它部位恶性肿瘤者。②合并患有全身严重感染性疾病者。③心、肾、肝脏功能严重不足者。④有胃部手术史。另选取同期本院体检的89 例健康者作为健康对照组，其中男54例，女35例，年龄31～74岁，平均（61.84±17.95）岁。各组年龄、性别比例比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经本院伦理委员会批准同意，患者及家属均对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 主要仪器和试剂

实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）仪（型号：7900，美国ABI公司）、qRT-PCR试剂盒（货号：RR820A，大连宝生物公司）、总RNA提取试剂盒（货号：KL073，上海康朗生物科技有限公司）、反转录试剂盒（货号：205311，德国Qiagen公司）、PGⅠ酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（货号：JK-(a)-1667，上海晶抗生物工程有限公司）、PGⅡELISA试剂盒（货号：JK-00116，上海晶抗生物工程有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 样本采集

所有入组患者和健康者分别于入组时和体检时清晨（7:00～9:00）空腹状态下采集外周静脉血5 mL，4 ℃、3 000 r/min离心20min后，取上清液分装于无菌EP管中，于-80 ℃条件下保存。

1.3.2 血清miR-625表达水平检测

采用qRT-PCR 法检测miR-625 表达水平。Trizol 法提取总RNA 后，反转录获得cDNA，用于qRT-PCR 实验。20 μL 反应体系：10µL Mix Taq II，0.8µL 上游引物，0.8µL 下游引物，2µL cDNA，0.4µL ROX，6.0µL ddH2O。具体反应步骤：95 ℃、35 s，1 循环；95 ℃、5 s；64 ℃、35 s，40 循环。每个样本重复3次，用2-ΔΔCT法计算miR-625表达水平，所用引物如表1所示。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 血清PGⅠ、PGⅡ、PGR水平检测

采用ELISA 法检测血清PGⅠ、PGⅡ表达水平并计算PGR 水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 统计学方法

采用SPSS 23.0 软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较用t检验；计数资料用百分率（%）表示，组间比较用χ²检验。采用Pearson 法进行相关性分析，采用Logistic 回归模型进行多因素分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清miR-625、PGⅠ、PGⅡ及PGR水平比较

胃癌组、慢性萎缩性胃炎组、慢性非萎缩性胃炎组PGⅡ水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。胃癌组、慢性萎缩性胃炎组、慢性非萎缩性胃炎组血清miR-625、PGⅠ及PGR水平均显著低于健康对照组（均P＜0.05）；胃癌组血清miR-625、PGⅠ及PGR 水平均显著低于慢性萎缩性胃炎组和慢性非萎缩性胃炎组（均P＜0.05）；慢性萎缩性胃炎组血清miR-625、PGⅠ及PGR水平均显著低于慢性非萎缩性胃炎组（均P＜0.05），见表2。

表2 各组血清miR-625、PGⅠ、PGⅡ及PGR水平比较

2.2 血清miR-625、PGⅠ、PGⅡ及PGR水平与胃癌患者临床病理特征关系

血清miR-625、PGⅠ、PGⅡ及PGR 水平在不同年龄、性别、肿瘤直径、浸润深度胃癌患者之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。另外，血清PGⅡ水平在分化程度、TNM 分期、淋巴结转移情况之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与肿瘤分化程度为高中分化、TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移胃癌患者相比，肿瘤分化程度为低分化、TNM 分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的胃癌患者血清miR-625、PGⅠ、PGR水平较低（P＜0.05），见表3。

表3 血清miR-625、PGⅠ、PGⅡ及PGR水平与胃癌患者临床病理特征关系

2.3 胃癌患者血清miR-625 与PGⅠ、PGR 水平相关性

胃癌患者血清中miR-625 与PGⅠ水平呈正相关关系（r=0.422，P=0.000），与PGR 呈正相关（r=0.501，P=0.000），见图1、图2。

图1 胃癌患者血清中miR-625与PGⅠ水平相关性

图2 胃癌患者血清中miR-625与PGR水平相关性

2.4 胃癌发生危险因素分析

以胃癌是否发生为因变量，TNM 分期、淋巴结转移、PGⅠ水平、PGR 水平及miR-625 水平为自变量进行logistic回归模型分析，结果发现有淋巴结转移、PGⅠ低水平、PGR 低水平及miR-625 低水平是影响胃癌发生的独立危险因素（均P＜0.05），见表4。

表4 胃癌发生危险因素分析

2.5 血清miR-625、PGⅠ及PGR联合检测对胃癌诊断效能

血清miR-625 预测胃癌敏感度为71.60%，特异度为85.70%，曲线下面积为0.849（图3）。PGⅠ预测胃癌敏感度为66.60%，特异度为84.50%，曲线下面积为0.784（图4）。PGR预测胃癌敏感度为79.70%，特异度为67.90%，曲线下面积为0.769（图5）。三者联合检测预测胃癌敏感度为97.60%，特异度为82.40%，曲线下面积为0.947（图6）。

图3 血清miR-625对胃癌诊断效能

图4 血清PGⅠ对胃癌诊断效能

图5 血清PGR对胃癌诊断效能

图6 血清miR-625、PGⅠ和PGR联合检测对胃癌诊断效能

3 讨论

PG 是胃蛋白酶前体，由泌酸腺主细胞合成，可反映胃黏膜形态和功能。PGⅠ水平升高与胃酸分泌增多有关，水平降低可能预示胃黏膜腺体萎缩等发生[3]。Su 等[8]研究发现，低PGR 值是萎缩性胃炎发生危险因素。本研究结果显示，血清PGⅠ、PGR在胃癌组、慢性萎缩性胃炎组、慢性非萎缩性胃炎组水平均明显低于健康对照组，提示血清PGⅠ及PGR水平可能与胃部疾病发生有关。本研究中，PGⅡ在各组中水平比较差异无统计学意义，可能原因是PGⅡ成熟腺细胞分泌，来源广泛不具特异性，而PGⅠ主要来源于胃主细胞和粘液细胞，能反映胃黏膜病变水平。

有研究表明，PG对检测胃癌癌前风险病变有一定价值，PGⅠ可能作为早期胃癌诊断标志物[9]。研究报道，血清PGⅠ及PGR水平在对照组、萎缩性胃炎组、胃癌组中逐渐降低[10]。本研究结果显示，与慢性萎缩性胃炎组和慢性非萎缩性胃炎组相比，胃癌组患者血清中PGⅠ、PGR水平均明显降低，与黄喜顺等[10]研究结果相似，提示低水平的血清PGⅠ、PGR水平可能与胃癌发生有关。有研究证实，晚期胃癌组与早期胃癌组患者PGⅠ水平比较，差异显著[11]。徐娟等[12]研究发现，不同TNM分期胃癌患者PGR差异有统计学意义，PGR对胃癌患者病情和预后评估有一定帮助。本研究结果发现，与肿瘤分化程度为高中分化、TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移胃癌患者相比，肿瘤分化程度为低分化、TNM 分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的胃癌患者血清PGⅠ、PGR 水平较低，与前人[11-12]研究结果相似，提示胃癌病情进展可能影响血清PGⅠ、PGR水平。

Zhou 等[13]研究报道，肝细胞癌中miR-625 低表达与肿瘤高TNM分期、淋巴结转移、远处转移及总生存期短有关。本研究结果显示，健康对照组、慢性非萎缩性胃炎组、慢性萎缩性胃炎组、胃癌组中miR-625 表达水平依次显著降低，提示miR-625 的表达异常可能与胃癌及不同类型胃炎的发生相关。费玲等[14]研究发现，非小细胞肺癌患者血浆miR-625 表达水平远低于肺良性疾病者，其表达变化与肿瘤的临床分期有关，且可作为临床诊断非小细胞肺癌的分子标记物。有研究证实，miR-625 在胃癌组织中表达水平下调，且低表达miR-625 患者的淋巴结转移、远处转移及总体生存率明显低于高表达miR-625 患者[15]。本研究结果显示，肿瘤分化程度为低分化、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的胃癌患者血清miR-625水平较低明显低于肿瘤分化程度为高中分化、TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移患者，提示miR-625 低表达可能与胃癌发展有关。

幽门螺旋杆菌是影响胃癌发病的主要因素之一，有研究发现，血清PGR 在幽门螺旋杆菌感染患者治疗后水平升高，可作为幽门螺旋杆菌根除治疗成功的评价标准[16]。梁艺钟等[17]研究发现，随着幽门螺杆菌根除率升高，慢性胃炎患者血清PGⅠ水平升高，提示PGⅠ和PGR 水平与幽门螺杆菌感染有关。有研究表明，IL-10基因多态性与幽门螺杆菌阳性患者消化性溃疡风险增加有关。Dong 等[18]研究报道，哮喘患儿血浆miR-625表达水平明显下降，可能通过靶向炎症细胞因子IL-10，导致哮喘发作，提示miR-625 可能通过IL-10 影响幽门螺杆菌感染水平。本研究结果发现，胃癌患者血清中miR-625 与PGⅠ、PGR表达水平呈正相关，提示miR-625与PGⅠ、PGR 之间可能存在相互作用，通过影响患者幽门螺杆菌感染，参与胃癌进展。但具体机制尚需进一步深入研究证实。

进一步研究发现，有淋巴结转移、PGⅠ低水平、PGR低水平及miR-625低水平是影响胃癌发生独立危险因素，进一步提示血清miR-625、PGⅠ、PGR低水平与胃癌发生有关，可能作为生物标志物，对预测胃癌发生有一定意义。本研究还发现，血清miR-625、PGⅠ、PGR 水平均对胃癌有一定诊断价值，但灵敏度或特异度较低，三者联合检测时的敏感度均比三者单独检测时高，提示三者联合检测对胃癌诊断效能较高，可能作为临床胃癌诊断指标。

综上所述，与健康对照组、慢性非萎缩性胃炎组、慢性萎缩性胃炎组相比，胃癌组患者血清中miR-625 表达水平明显降低，与PGⅠ、PGR 水平呈正相关，且与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关。miR-625、PGⅠ、PGR低水平是胃癌发生独立危险因素。血清miR-625、PGⅠ、PGR 联合检测对胃癌诊断具有一定价值。但由于本研究样本量较少，研究方法较为单一，具体机制尚需大量实验进一步深入研究。