下调miR-155通过抑制HIF-1α/VEGF通路增强人结直肠癌细胞的放射敏感性*

刘 黎，杨 帆，张 匠，冷 娇，刘雪梅，王晓华，梁 龙，董华琼△

（1.四川省遂宁市中心医院，遂宁 629000；2.四川省肿瘤医院，成都 610041）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是临床最常见的消化道恶性肿瘤之一，近期资料显示，在全球范围内，随着社会经济的发展，人们生活方式、饮食结构的改变，CRC的发病率和致死率呈逐年上升趋势[1-2]。CRC 占恶性肿瘤第3 位，其主要的致死因素是复发和转移[3]。尽管早期的CRC患者通过外科手术后5 年内的生存率有所提高，但是中晚期的CRC患者往往预后较差，长期生存率较低[4]。目前，放射治疗是CRC的主要治疗方式之一，但是治疗过程中放疗抵抗的存在，严重的影响了放疗效果。因此，进一步探索CRC 的发生发展、侵袭转移机制，从而寻找抑制放疗抵抗的新的治疗靶点至关重要。miRNAs 是一类22～25 nt 内源性的非编码的单链小分子RNA，通常在转录后水平调节基因的表达来发挥生物学作用[5]。miRNAs与恶性肿瘤密切相关，可调控肿瘤的发生发展以及转移[6]。近年来研究发现miRNA-155在多种肿瘤中发挥重要作用，并且miRNA-155在CRC组织中的表达相比于癌旁组织显著上升，提示可能参与CRC 的发生发展过程[7]。但是目前尚未见研究报道阐明miRNA-155 的异常表达对CRC细胞放射敏感性的影响。因此，本研究主要探究miRNA-155对CRC细胞SW620放射敏感性的影响及其作用机制，旨在为临床研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

CRC 细胞SW620（中国科学院细胞库）；RPMI 1640培养基和胚牛血清（美国Hyclone公司）；CCK8试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；LipofectamineTM2000（美国Invitrogen 公司）；anti-miRNA-155 and anti-miRNA-155 negative control(吉玛生物技术有限公司)；qRT-PCR 试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；BCA试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；HIF-1、VEGF 山羊抗兔二抗（中国赛默飞世尔科技有限公司）；细胞凋亡检测试剂盒（中国赛默飞世尔科技有限公司）；细胞培养箱（苏州净化设备制造厂）；医用高能电子直线加速器（美国Varian 公司）；凝胶成像仪（美国Bio-Rad 公司）；实时荧光定量PCR 仪（德国SensoQuest Lab Cycler 公司）；流式细胞仪（BECKMAN）。

1.2 细胞培养

采用RPMI 1640培养基（包含10%胚牛血清和1%青霉素/链霉素）于37 ℃，5%CO2恒温细胞培养箱中培养SW620细胞。每隔24 h换液1次，细胞融合度达到80%时，进行传代培养。所有实验均取对数生长期的细胞。

1.3 细胞转染

采用对数生长期SW620 细胞接种于6 孔板中（2×105个/每孔），培养至细胞密度为70%～80%时，参照LipofectamineTM2000 说明书将anti-miRNA-155、anti-miRNA-155 NC 转染至SW620 细胞中，并标记为anti-miR-155 组和NC 组。转染6 h 后，更换新鲜培养液继续培养24 h，收集各组细胞采用qRTPCR 检测细胞中miRNA-155 的表达用来评价细胞转染效率。

1.4 细胞电离辐射

转染后的SW620 细胞用6 MV-X 射线，医用高能电子直线加速器进行照射，照射源距离为100 cm，剂量率为2 Gy/min，给予剂量为4.0 Gy。细胞培养瓶下方加1 cm厚的有机玻璃板，上方覆盖1 cm厚的胶体。

1.5 CCK8分析检测细胞活力

将100 μL 转染后的SW620 细胞悬液（5×104个/mL）接种于96孔板，于37 ℃，5%CO2恒温细胞培养箱中孵育，待细胞完全贴壁，6 MV-X 射线处理细胞。处理后各组细胞正常条件下培养0 h、24 h、48 h、72 h，每孔加入10 μL CCK8 溶液，混匀后放入恒温培养箱继续培养1 h。使用酶标仪测定450 nm处各孔的吸光度（OD值）。

1.6 qRT-PCR分析

按照总RNA 提取试剂盒说明书步骤提取SW620细胞的总RNA，根据反转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。miRNA-155、内参U6引物由武汉金开瑞生物工程有限公司合成，序列如下：miRNA-155 上游引物为5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3’，下游引物为5’-TATTCGCACTGGATACGACCCCCTA-3’；内参U6 上游引物为5’-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3’，下游引物为5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。取PCR 上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板cDNA 1 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，RNase free water 7 μL 配置成总体积为20 μL的反应体系。实时荧光定量PCR仪进行PCR 扩增，两步法程序为：94 ℃2 min(预变性),94 ℃10 s(变性)、60 ℃30 s(退火)、72 ℃30 s(延伸),共35 个循环。用2-△△CT检测miRNA-155 的表达水平。

1.7 克隆形成实验检测放射生物学参数

转染后的SW620 细胞用胰蛋白酶消化，重悬，细胞浓度稀释至5×103个/mL接种于6孔板中，37 ℃培养过夜。以0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy的6 MVX射线垂直照射各组细胞，照射结束后，于恒温培养箱中继续培养10～15 d，至出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去培养基，用4%甲醛固定15 min，姬姆萨染液染色30 min，弃去染液后显微镜下观察，并以细胞集落≥50 作为有效克隆。克隆形成率（PE）以(克隆数/接种细胞数)×100%表示，各组细胞的存活分数（SF）根据公式：存活分数(SF)=克隆数/(PE×接种细胞数)进行计算。根据GraphPad Prime7.0 软件构建多靶单击模型拟合细胞剂量存活曲线，计算放射生物学参数：平均致死量（D0）、准阈剂量（Dq）、照射剂量2 Gy下细胞存活分数（SF2）和放射增敏比（SER）。

1.8 细胞划痕实验

将转染后的SW620细胞电离辐射，用胰蛋白酶消化后重悬，稀释至细胞浓度为5×105个/mL，吸取1 mL接种于6孔板中，放置在37 ℃培养箱中继续培养。待细胞长满后，用无菌的200 μL枪头在6孔板中央轻轻划过，接着用灭菌的PBS 清洗细胞，加入1 mL 无血清培养基，放入培养箱中继续培养。取0 h、24 h分别在光学显微镜下进行观察并拍照。

1.9 Transwell小室检测细胞侵袭

将转染后经电离辐射的SW620 细胞用胰酶消化，加入无血清的RPMI 1640 培养基制备成浓度为3×105个/mL的细胞悬液，吸取200 μL细胞悬液加入Transwell 上室，下室每孔加入600 μL 含10% FBS的RPMI 1640 培养基，放入37 ℃5%CO2细胞培养箱中继续培养24 h。取出Transwell小室，用棉签擦去上层未迁移的细胞，灭菌的PBS 清洗3 次，4%多聚甲醛固定20 min，结晶紫染色15 min。显微镜下观察，每孔随机选取5个视野拍照并计数，这些视野中细胞的平均值为Transwell 小室细胞迁徙的细胞数目。

1.10 流式细胞术检测细胞凋亡

SW620 细胞转染anti-miRNA-155 和anti-miRNA-155 NC后，使用6 MV-X射线照射细胞，正常条件下继续培养24 h。胰酶消化，用2 mL1×Banding Buffer 稀释成细胞密度为1×106个/mL 的细胞悬液。取100 μL 加入灭菌的1.5 mL EP 管中，然后加入5 μL AnnexinⅤ-FITC 和10 μL PI，室温下避光温育15 min。使用流式细胞仪检测各组样品，分析并统计细胞凋亡数。

1.11 双荧光素酶报告基因检测

采用双荧光素酶报告基因分析，进一步证实了miR-155与目标基因HIF-1α 3’-UTR的结合。将含有HIF-1α的3’-UTR的野生型或突变型片段克隆到psiCHECKTM-2 载体（美国Promega）中，形成Luc-WT-3’-UTR载体或Luc-MUT-3’-UTR载体。然后，将miR-155mimics 或其对照（mimics NC）和荧光素酶报告载体共转染到SW620细胞中。转染24 h后检查荧光素酶活性。

1.12 Western blotting检测

用RIPA 裂解液提取转染后放射处理的SW620细胞的总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度。将变性蛋白以40 μg/每孔上样至10%SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离蛋白，将分离的蛋白样品电转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。转膜后，将PVDF 膜放入含5%脱脂奶粉的封闭液中封闭2 h，接着加入稀释好的GAPDH、HIF-1α、VEGF 一抗（1∶1 000），4℃孵育过夜。然后再加入稀释的山羊抗兔二抗（1∶4 000）室温下孵育1 h。按照ECL试剂盒说明书配制发光液，用Bio-Rad成像仪显影。

1.13 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差()表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染后SW620细胞中miRNA-155的表达下调

SW620 细胞转染anti-miRNA-155 和anti-miRNA-155 NC后，用qRT-PCR检测miRNA-155的表达水平。转染anti-miRNA-155 后SW620 细胞中miRNA-155的表达水平（0.35±0.11）相比于NC组（0.98±0.05）显著降低（t=9.13，P＜0.05)；而对照组与NC组相比，miRNA-155的表达水平无明显变化（P＞0.05），见图1。

图1 各组细胞中miRNA-155的表达水平比较

2.2 放射线照射后miRNA-155对SW620细胞放射生物学参数的影响

使用6MV-X射线对转染后的SW620细胞进行放射处理，克隆形成实验检测各组细胞放射生物学参数，其相关参数，见表1。与NC组相比，anti-miRNA-155 组细胞的D0值、Dq值、SF2值显著降低（P＜0.05），放射增敏比SER 为1.67±0.75。克隆形成实验结果显示，下调miRNA-155能明显增强结直肠癌SW620细胞的放射敏感性。

表1 各组SW620细胞放射生物学参数比较

表1 各组SW620细胞放射生物学参数比较

2.3 下调miRNA-155对放射线照射后SW620细胞的增殖能力的影响

CCK8 检测结果显示，anti-miRNA-155 组直肠癌SW620细胞增殖能力在各时间点均显著低于NC组（t24h=3.319、t48h=5.124、t72h=8.141，P＜0.05），见图2。

图2 anti-miRNA-155对SW620细胞增殖能力的影响

2.4 下调miRNA-155对放射线照射后SW620细胞的迁移能力的影响

划痕愈合实验检测放射线照射后SW620 细胞的迁移能力。结果显示，与NC 组相比，anti-miRNA-155 组SW620 细胞愈合率显著降低（t=4.708，P＜0.01），见图3。

2.5 下调miRNA-155对放射线照射后SW620细胞的侵袭能力的影响

使用Transwell 小室法检测放射线照射后SW620 细胞的侵袭能力。与NC 组相比，anti-miRNA-155 组SW620 细胞穿越Matrigel 胶的能力受到抑制，细胞侵袭数量明显减少（t=6.007，P＜0.01），见图4。

图4 下调miRNA-155对SW620细胞侵袭能力的影响

2.6 下调miRNA-155促进放射线照射后的SW620细胞凋亡

通过流式细胞术检测下调miRNA-155 对电离辐射处理的SW620 细胞凋亡的影响。放射线照射后anti-miRNA-155组和NC组中细胞的凋亡率分别为(8.96±0.39)%和(2.28±0.16)%，见图5A。与NC 组相比较，anti-miRNA-155组SW620细胞凋亡率显著上升（t=15.73，P＜0.01），见图5B。

图5 下调miRNA-155对SW620细胞凋亡的影响

2.7 miRNA-155靶向调节HIF-1α的表达

通过生物信息学软件预测，发现miRNA-155与HIF-1α的3’-UTR存在结合位点，见图6A。双荧光素酶报告基因试验结果表明，miRNA-155mimics显著降低HIF-1α 的WT-3’-UTR 的荧光素酶活性，但不降低突变型的，图6B。

图6 miRNA-155靶向HIF-1α

2.8 下调miRNA-155 对SW620 细胞中HIF-1α 和VEGF水平的影响

采用Western blotting检测技术分析电离辐射的SW620细胞中HIF-1α 和VEGF表达水平。经过6MV-X 射线照射24 h后，anti-miRNA-155组SW620细胞中HIF-1α 和VEGF 表达水平显著低于NC 组，见图7。

图7 下调miR-155对SW620细胞中HIF-1α和VEGF蛋白表达量的影响

3 讨论

CRC是一种高发的消化系统恶性肿瘤，其具有浸润性生长、恶性程度高、容易发生侵袭转移和复发等特点，导致治疗后患者总体生存率极低[8-9]。因此，探究CRC的侵袭转移机制以及发现抑制放射耐受的新治疗靶点迫在眉睫。miRNAs可调节促癌基因或抑癌基因参与肿瘤细胞的增殖、转移、侵袭等过程，其可作为肿瘤早期诊断的生物标志物和靶向治疗的特异性靶点[10-12]。已有研究报道，miRNA-155 在多种肿瘤组织中异常高表达，提示可能作为癌基因促进癌细胞的转移和侵袭[13]。有研究报道，miRNA-155参与调控乳腺癌、肾癌等癌细胞的侵袭和转移[14-15]。此外，2 Gy 射线辐射人脐静脉内皮细胞24 h 时可显著增加miRNA-155 的表达，miRNA-155 与细胞辐射耐受性密切相关[16]。但是目前还少有相关研究阐明miRNA-155 调控CRC 细胞的迁移、侵袭和放射耐受性的分子机制。本研究通过电离辐射转染anti-miRNA-155的SW620细胞，利用克隆形成实验检测各组细胞放射生物参数。本研究发现，下调miRNA-155 后SW620 细胞的D0值、Dq值、SF2值均显著降低，SER为1.67±0.75。以上实验结果表明，下调miRNA-155 可降低SW620 细胞的放射耐受性，与先前的研究结论吻合。本研究结果显示，下调miRNA-155 后的SW620 细胞经过放射线照射，其增殖、迁移和侵袭能力明显降低；同时，促进细胞凋亡。结果表明，miRNA-155调控CRC细胞侵袭和转移可能与其在已证实的其他癌症转移的分子机制类似。

为了进一步探究miRNA-155 调控CRC 细胞侵袭和迁移的分子机制，通过生物信息学软件预测发现，miRNA-155的可能靶基因是HIF-1α。通过双荧光素酶报告基因试验证实HIF-1α 是miRNA-155 的靶基因。HIF-1α是具有转录活性的核蛋白，其与炎症、血管生成、细胞增殖和细胞凋亡密切相关，可作为转录因子促进不同种类肿瘤的转移[17]。本研究表明，下调miRNA-155 降低了HIF-1α 蛋白的表达。研究已证，HIF-1α 被激活后通过活化PI3K/AKT 通路，抑制HIF-1α 羟基化后的降解，积聚的HIF-1α 启动VEGF 的表达，从而促进肿瘤新血管生成[18]。VEGF 是目前发现的重要的血管生成的调节因子，它的表达与肿瘤侵袭能力呈明显正相关[19]。VEGF是HIF-1α的下游靶基因，HIF-1α的上调诱导VEGF基因表达和肿瘤血管生成，进而促进肿瘤细胞的生长和转移。本研究发现，下调miRNA-155能显著降低VEGF 的表达水平[20]。以上结果提示，下调miRNA-155 可能是通过抑制HIF-1α/VEGF 信号通路降低SW620细胞的增殖、迁移和侵袭的能力。

综上所述，下调miRNA-155能增强结直肠癌细胞SW620的放射敏感性，抑制其增殖、迁移和侵袭，其作用机制可能是抑制HIF-1α/VEGF 信号通路的激活。