Linc00261调控miR-139-3p对子宫内膜异位症小鼠异位内膜细胞黏附、侵袭和凋亡的影响*

张青林，朱紫琼，蒋子雯，徐铭军

（首都医科大学附属北京妇产医院，北京 100006）

子宫内膜异位症（Endometriosis,EMs）是一种子宫内膜组织异常位于子宫外的妇科疾病，其治疗方案目前以药物治疗和手术治疗为主，但药物治疗通常副作用较大，手术治疗风险较高、预后差[1-6]。近年来，随着分子生物学的发展，lncRNAs 和miRNAs在EMs中的作用逐渐受到关注[7-8]。近年来，长链非编码RNA(long non coding RNA,lncRNA)被发现能在宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌等多种妇科疾病中起到调控作用[9-11]。先前研究表明，CCDC144NLAS1、MALAT1 等多种lncRNA 能调控EMs 的进展，且不同lncRNA 起到的作用不同[12-13]。有报道Linc00261能抑制EMs细胞的增殖和侵袭[14]。此外，LncRNA 也能够与miRNA 竞争性结合进而在生物学过程中发挥调控作用，如LncRNASOX21-AS1 能够靶向抑制miR-7 的表达，从而促进宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭，加速宫颈癌进展[15]。本研究通过生物学信息工具预测了Linc00261 的潜在靶点，筛选出miR-139-3p 作为研究对象。Xu 等[16]发现miR-139-3p能抑制Bcl-6的表达，进而阻碍宫颈癌细胞的迁移和侵袭，而这种作用会受到CIRC_0031288 的靶向抑制；Xue 等[17]发现miR-139-3p 能靶向抑制ELAVL1 的表达，从而抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移。miR-139-3p能够调控多种妇科疾病的进展，但是关于其影响EMs 的作用及机制尚未明确。本研究旨在探究Linc00261/miR-139-3p对EMs小鼠异位内膜细胞黏附、侵袭和凋亡的影响，以期进一步明确其分子机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备 SPF级BALB/c雌性小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。戊酸雌二醇（222A）购自拜耳医药广州分公司，缩宫素（120509）购自上海禾丰制药，庆大霉素（G8170）购自北京索莱宝，RIPA裂解液（KL131008250）购自上海康朗生物科技有限公司，pMIR 报告载体（E1330）购自Promega，双荧光素酶报告试剂盒（RG027）、Tunel 试剂盒（C1098）购自上海碧云天，Trizol 试剂盒（15596-026）购自Invitrogen，SYBR Green 荧光定量PCR 试剂盒（JKG039）购自上海经科化学，蛋白抗体MMP2（ab181286）、MMP9（ab228402）、VCAM-1（ab134047）、ICAM-1（ab222736）、Bax（ab182734）、Bcl-2（ab182858）、二抗山羊抗兔IgG（ab133470）均购自ABCAM。荧光定量PCR仪（7500）购自美国ABI公司，光学显微镜购自上海光学仪器厂。引物序列由上海吉凯基因公司合成。

1.2 EMs小鼠模型构建及分组 将购买的80只6～8 周龄SPF 级近交系BALB/c 雌性小鼠分为假手术组（10只，Sham组）与模型组（70只，EMs组）。Sham组小鼠开腹后立即缝合，EMs 组小鼠在术前2 d 以戊酸雌二醇片（0.5 mg/kg）灌胃，使小鼠处于动情期，建模时通过5%戊巴比妥钠进行麻醉，于腹部进行消毒后在小鼠尿道口上方3 cm正中做2 cm切口，找到左侧子宫，于距离卵巢1 cm处进行结扎子宫两头，取中间子宫2 cm 切下，将切下的子宫组织内膜去除多余的脂肪组织后贴附于右侧腹壁、距腹部切口1.5 cm 处，通过4-0 手术线对子宫组织两头进行固定，之后对伤口进行缝合。小鼠在术后于腹部涂抹庆大霉素预防感染。将EMs小鼠分组：pcDNA组（尾静脉注射pcDNA）、pcDNA-Linc00261 组（尾静脉注射pcDNA-Linc00261）、miR-NC 组（尾静脉注射miR-139-3p mimic阴性对照）、miR-139-3p mimic组（尾静脉注射miR-139-3p mimic）、mimic+pcDNALinc00261 组（尾静脉注射miR-139-3p mimic 和pcDNA-Linc00261），每组10 只。所有小鼠连续在上午注射12 d，下午给予0.5 mg/kg 戊酸雌二醇灌胃，第12天末次给予戊酸雌二醇后1 h，为每只小鼠腹腔注射0.2 mL 缩宫素从而诱发扭体反应。当小鼠呈现明显扭体反应，移植物呈小囊状且明显增大同时伴有血管生成时，通过病理检查子宫内膜腺体细胞和间质细胞增多时视为建模成功[18]。本研究经我院动物伦理委员会审批同意。

1.3 亚细胞定位和靶向关系验证 首先通过NONCODE (http://www.noncode.org) 数据库了解Linc00261的序列信息，之后通过LncRNA定位数据库LncLocator（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/lncLocator/）对Linc00261 进行亚细胞定位预测。FISH 实验检测细胞中Linc00261 的表达定位。RNA22 网站预测Linc00261 以及miR-139-3p 的互补核苷酸序列，人工合成Linc00261 基因片段并且借助内切酶位点Spel 和Hind Ⅲ将其引入pMIR 报告载体。于Linc00261 野生型（WT）上设计互补的突变（MUT）位点，酶切后借助T4 DNA 连接酶将设计好的目的片段构建入pMIR报告载体。之后将测序无误的WT 和MUT 荧光素酶报告质粒分别与miR-139-3p mimic 和miR-139-3p NC共转染至HEK-293T细胞。连续转染48 h并对细胞进行裂解后借助双荧光素酶试剂盒对荧光素酶活性进行检测，操作步骤均依据试剂盒说明书。

1.4 实时荧光定量PCR (qPCR)检测相关因子mRNA 表达量 Trizol 试剂盒用于提取组织中总RNA。利用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒完成PCR反应，反应体系和反应条件均依据试剂盒说明书进行。使用实时荧光定量PCR 仪进行扩增，Linc00261 引物序列为（上游：ACCCCGGAGAATCAGGCTCTA，下游：TCACCGGAATGCCGAACCA），以GAPDH为内参，miR-139-3p序列为（上游：CTCCGCACCATCCATGAA，下 游：CAAATGGTGCTTCAACCGC），以U6为内参。采用2-ΔΔCt法计算相关因子表达量。

1.5 Western blotting 检测相关因子蛋白表达 用RIPA 裂解液对组织中蛋白进行裂解，BCA 试剂盒测定蛋白浓度。行SDS-PAGE凝胶电泳后转移蛋白至PVDF 膜，胎牛血清封闭后将膜与一抗MMP2（1∶1 000）、MMP9（1∶1 000）、VCAM-1（1∶2 000）、ICAM-1（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶2 000）共同孵育。加入二抗山羊抗兔IgG（1∶2 000），ECL反应液显影，GAPDH作为内参，目标条带与内参灰度值之比为蛋白表达量。Image J软件分析灰度值。

1.6 Tunel荧光染色检测细胞凋亡 二甲苯和乙醇浸洗切片，PBS冲洗，Proteinase K工作液处理20 min，制备Tunel 反应混合液（含TdT 和荧光素酶标记的dUTP液），PBS漂洗，玻片干后加入50µL converter-POD，湿盒内反应30 min。PBS 漂洗，DAB 显色，PBS漂洗，苏木素复染，自来水冲洗，脱水、封片后光学显微镜下观察阳性细胞并计算凋亡比率。

1.7 统计学方法 采用SPSS软件（17.0版）进行分析数据。计量资料以均数±标准差（）表示，符合正态分布和方差齐性的数据组内和组间比较分别采用配对和非配对t检验，不符合的则采用秩和检验。多组间比较采用单因素或重复测量数据方差分析，组内两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Linc00261在EMs中表达被抑制而miR-139-3p表达增强 相对于假手术组中Linc00261（1±0.08）和miR-139-3p（1±0.11）的表达，EMs组Linc00261的表达（0.42±0.05）降低而miR-139-3p 表达（1.86±0.17）增强（均P＜0.05），见图1。

图1 Linc00261和miR-139-3p的表达

2.2 Linc00261与miR-139-3p的互作用 LncLocator 数据库显示Linc00261 主要定位于细胞质（图2A），推测其能够作为ceRNA吸附靶miRNA发挥功能。FISH 实验显示，Linc00261 的表达主要分布在细胞质（图2B）。通过RNA22 网站进一步发现Linc00261 和miR-139-3p 存在互作用位点（图2C），双荧光素酶报告实验进一步验证，相对于阴性对照组（1±0.08），共转染miR-139-3p 和Linc00261 野生型序列的组中荧光素酶活性被显著抑制（0.48±0.05）（图2D）。

图2 Linc00261和miR-139-3p的靶向关系验证

2.3 Linc00261抑制EMs小鼠异位内膜组织中侵袭和黏附相关因子的表达 与pcDNA 组比较，pcDNA-Linc00261组异位内膜组织中MMP2、MMP9和VCAM-1、ICAM-1的表达明显下降（均P＜0.05），见图3。

图3 Linc00261对侵袭转移和黏附相关因子表达的影响

2.4 Linc00261促进EMs小鼠异位内膜细胞凋亡 相对于pcDNA组的凋亡率（13.5±1.2）以及凋亡相关因子Bax（0.45±0.04）、Bcl-2（1.47±0.15）的表达，pcDNA-Linc00261 组异位内膜组织中凋亡率（27.4±2.2）显著增升高，同时，Bax（1.23±0.11）表达增强而Bcl-2（0.67±0.06）表达被抑制（均P＜0.05），见图4。

图4 Linc00261对异位内膜组织细胞凋亡的影响

2.5 miR-139-3p mimic逆转Linc00261对EMs小鼠异位内膜组织侵袭和黏附相关因子表达的影响 相对于miR-NC组，miR-139-3p mimic 组中MMP2、MMP9、VCAM-1和ICAM-1表达增强（均P＜0.05），见图5。miR-139-3p mimic能够逆转Linc00261对EMs 小鼠异位内膜组织侵袭和黏附相关因子表达的影响。

图5 Linc00261吸附miR-139-3p调控异位内膜组织侵袭和黏附相关因子表达

2.6 miR-139-3p mimic逆转Linc00261对EMs小鼠异位内膜组织细胞凋亡的影响 相对于miR-NC组的凋亡率（14.85±1.33）以及凋亡相关因子Bax（0.51±0.05）、Bcl-2（1.39±0.12）的表达，miR-139-3p mimic 组中凋亡（6.74±0.65）显著减少，Bax 表达（0.22±0.02）降低而Bcl-2 表达（1.78±0.16）增强（均P＜0.05）。Linc00261 对异位内膜细胞凋亡以及Bax、Bcl-2表达的影响能够被miR-139-3p过表达逆转（均P＜0.05），见图6。

图6 Linc00261吸附miR-139-3p调控异位内膜组织细胞凋亡

3 讨论

随着分子生物学的发展以及非编码RNA 的发现，关于LncRNAs与miRNAs作为EMs生物标志物的探讨受到了广大学者的青睐，疾病的发生会导致LncRNAs 和miRNAs 表达 异常，LncRNAs 和miRNAs 的异常表达同样会对疾病的进程产生影响[19-20]。本研究探讨Linc00261 吸附miR-139-3p 对EMs进展的影响。

研究发现，Linc00261 在卵巢癌组织中表达显著下调，过表达Linc00261 能够有效抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭，Linc00261 也被认为是卵巢癌诊断和治疗的潜在靶点[21]。先前研究表明，Linc00261 在EMs 异位内膜组织中表达显著下调，并且能够与miR-132-3p 竞争性结合进而参与疾病的进展[14]。此外，Sha 等[22]在研究中发现Linc00261能够抑制EMs细胞的生长和迁移与前人结果一致，本研究发现Linc00261 在EMs 小鼠组织中表达降低，提示Linc00261可能与Ems的发生发展有关。

通常LncRNAs能够作为分子海绵，竞争性吸附miRNAs，抑制其进一步作用。例如，LncRNAH19通过竞争性抑制miR-216a-5p 与ACTA2 结合，促进EMs 细胞的侵袭和迁移[23]。本研究结果显示，Linc00261 与miR-139-3p 之间存在靶向关系，且二者表达量呈负相关，提示miR-139-3p 可以被Linc00261 海绵化。在先前的研究中，miR-139-3p在宫颈癌、卵巢癌等妇科疾病组织或细胞中表达降低，能起到抑制肿瘤细胞增殖、侵袭的作用[16-17]。本研究结果与文献报道的不一致，笔者认为可能是由于miR-139-5P 在不同疾病中发挥不同功能所导致的，滋养层细胞的确都具有侵袭性等特点，miR-139-5P 促进滋养层细胞侵袭可能是通过调控MMP2、MMP9 等实现的。本研究对miR-139-3p 在EMs 中的表达进行了探究，结果表明，其在EMs 小鼠组织中表达增高，提示其可能参与EMs的发病。

细胞的转移和侵袭是一个多步骤的过程，细胞受到黏附因子的调控先后与内皮细胞、内皮下基底膜和实质器官宿主细胞发生黏附及去黏附，从而实现在机体中的运动[24]。其中，VCAM-1 和ICAM-1作为免疫球蛋白家族成员，被广泛报道为细胞黏附相关因子，而MMPs 则对细胞的去黏附产生影响[25]。MMPs是一类能够降解细胞外基质和基底膜成分的蛋白水解酶，参与癌细胞的转移和侵袭，MMP2和MMP9被发现能降解Ⅳ型胶原[26]。通常情况下，癌组织中VCAM-1、ICAM-1、MMP2、MMP9的表达水平高于正常癌旁组织[27-28]。而癌细胞的凋亡则是受到凋亡相关蛋白的调控，最常见的指标是Bax 和Bcl-2[29]。本研究发现，过表达Linc00261 或者抑制miR-139-3p 的表达能降低EMs 小鼠组织中VCAM-1、ICAM-1、MMP2、MMP9、Bcl-2的表达量，上调Bax 的表达，从而抑制EMs 细胞的黏附、侵袭和转移，促进其凋亡。

综上所述，Linc00261 能够作为分子海绵竞争性抑制miR-139-3p的表达，从而抑制EMs异位内膜细胞的黏附和侵袭转移，促进细胞凋亡。Linc00261/miR-139-3p轴有望成为治疗EMs的新的分子机制网络。但是本研究仍然存在一定不足之处，例如没有对miR-139-3p调控的下游基因作相关探究，样本量有待进一步增加等，这也是需要我们日后进一步完善的地方。