低温常压等离子体改善牙本质-全酸蚀粘接系统粘接效果的体外研究

王钦鸿 王丹杨 谢娜 唐成芳 李子夏 王路明

[摘要]目的：本研究擬观测低温常压等离子体射流处理对牙本质-全酸蚀粘接系统粘接效果及牙本质胶原纤维耐NaClO降解的效果。方法：离体牙去除牙合面牙釉质，暴露的牙本质打磨后酸蚀15s并冲洗，随后用NTAPP射流分别处理牙面0、5、10、15、20s，常规制作微拉伸粘接试件，每组有一半试件冷热循环10 000次，分别检测各组循环前后牙本质粘接强度。获取中层牙本质片，酸蚀后经NTAPP处理0、5、10、15、20s后，分别浸泡于5% NaClO溶液中0、30、60、120s，扫描电镜观察各组脱矿牙本质胶原的降解情况。对各组粘接强度进行统计分析。结果：所有NTAPP处理组的微拉伸粘结强度（Micro-tensile bond strength，?TBS）值均显著高于对照组;NTAPP处理5s组的?TBS值显著高于其他组;老化后NTAPP处理5s和10s组的?TBS值显著高于其他各组。扫描电镜观察脱矿胶原显示，随着NaClO溶液处理时间延长，各组牙本质胶原均呈现不同程度降解，对照组120s胶原完全消失，但NTAPP处理组仍可见胶原纤维残留。NTAPP处理5和10s经NaClO浸泡30s后，胶原纤维网结构完整。NTAPP处理15和20s，使部分胶原纤维凝结变性。结论：采用合适的参数及处理时间，NTAPP可有效保护牙本质胶原纤维并提高牙本质-全酸蚀粘接界面的耐久性。

[关键词]等离子体;牙本质;微拉伸粘接强度;粘接持久性;胶原;全酸蚀粘接剂

[中图分类号]R783    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2021）07-0093-04

In Vitro Study of Non-thermal Atmospheric Pressure Plasma in Improving the Bonding Effect of Dentin with an Etch-and-rinse System

WANG Qin-hong1，WANG Dan-yang1，XIE Na2，TANG Cheng-fang1，LI Zi-xia2，WANG Lu-ming3

（1.Department of Prosthodontics;2.Department of Oral Medicine，School of Stomatology，Xian Medical University，Xian 710021，Shaanxi，China;3.Department of Stomatology，the Second Affiliated Hospital of Xian Medical University，Xian 710038，Shaanxi，China）

Abstract： Objective  To evaluate the bonding effect of non-thermal atmospheric pressure plasma treatment on the dentin-adhesive interface with an etch-and-rinse system and the degradation resistance of collagen under the sodium hypochlorite （NaClO） challenge. Methods  The occlusal enamel of each tooth was removed. The exposed and polished dentin surface was etched for 15s and rinsed. The etched dentin surface was exposed to the plasma jet for 0， 5， 10， 15， 20s. Then the micro-tensile bonding specimens were made following the method described previously. Half of the specimens in each group were thermo-cycled 10 000 times. The micro-tensile bonding specimens from each tooth were subjected to μTBS testing. The dentin slabs of middle part from each tooth were treated with plasma jet for 0， 5， 10， 15， 20s after etched， and further immersed in 5% NaClO solution for different treatment times （0， 30， 60 and 120s）. All specimens were observed under FE-SEM. The results of μTBS were analyzed with SPSS. Results  The μTBS values of all NTAPP treatment groups were significantly increased compared with the control group. The T-5 group presented statistically higher μTBS values than any other groups. After thermocycling aging， the μTBS values of 5 and 10s groups were significantly higher than those of the other groups. Collagen fibrils presented with various levels of degradation in each group， with increasing NaClO treatment time. After NaClO treatment for 120s， the collagen fibrils of control group were completely degraded. However， residue collagen fibrils were still observed in the NTAPP treatment group. Collagen fibrils of 5 and 10s groups presented well-formed open networks after NaClO treatment for 30s. After NTAPP treatment for 15 and 20s， some demineralized collagen fibrils were melted and degenerated. Conclusion  Under optimal in vitro conditions， NTAPP treatment is effective in enhancing the dentin–bonding strength， improving the durability of the dentin–adhesive interface， and modifying the degradation resistance of collagen under NaClO challenge.

Keywords： non-thermal atmospheric pressure plasma; dentin; micro-tensile bond strength; bonding durability; collagen; the etch-and-rinse adhesive system

牙體组织与修复材料之间形成牢固且长效的粘接力对口腔粘接修复至关重要。牙本质的粘接依赖于混合层结构的形成[1]，但现有的全酸蚀粘接系统及自酸蚀粘接系统会在混合层底部形成缺陷带及纳米渗漏，使部分牙本质胶原失去粘接剂的保护作用而裸露，易受到水分以及各种蛋白水解酶的作用发生降解，引起牙本质粘接界面的退变[2-5]。因而，如何有效提高牙本质胶原纤维交联度，减少胶原裸露，是改善牙本质粘接界面耐久性的主要手段。低温常压等离子体（Non-thermal atmospheric pressure plasma，NTAPP）是近年来一种新兴的表面处理技术，可以产生大量带电粒子、各种离子、自由基、活性氧等活性物质，并且在能量转换时对周围环境的加热作用较弱，因此可保持较低温度，使得等离子体技术可以应用于热敏感性较高的生物组织[6]。已有研究表明[7]，NTAPP处理可以改变牙本质表面理化性能，提高牙本质即刻粘接强度。有学者推测NTAPP处理可使胶原纤维的二级结构发生改变[7]，但这种改变是否能够增加胶原的交联度提升其生物力学强度，从而改善牙本质粘接界面耐久性，目前尚不明确。本研究拟探讨NTAPP处理牙本质后，对其粘接持久性、胶原耐降解性的影响，以期为NTAPP在口腔粘接领域的应用提供可靠的理论依据。

1  材料和方法

1.1 主要仪器：万能材料试验机（Shimadzu公司，日本），场发射扫描电镜（field emission scanning electron microscope，FE-SEM，JSM-7500F，Jeol，日本），光固化机（Dentsply公司，美国），37℃水浴恒温箱（上海方瑞仪器有限公司），低速金刚石切割机（沈阳科晶自动化设备制造有限公司），低温常压等离子体发生装置（CTP-2000K，南京苏曼等离子科技有限公司），示波器（MSO1104Z，苏州普源精电科技有限公司），齿科冷热循环机（西安世纪测控技术研究所）。

1.2 主要试剂和材料：Single Bond 2全酸蚀粘接剂、Filtek Z250复合树脂（3M公司，美国），37%磷酸酸蚀剂（Vericom 公司，韩国），高纯度氦气（99.999%，西安天盛气体有限公司），去离子水。

收集新鲜无龋的第三磨牙（西安医学院第二附属医院口腔科），患者知情同意，刮除附着软组织，清洗后生理盐水中4℃保存，于1周内使用。本研究由西安医学院伦理委员会审查通过，批准号为XYLS2020142，患者均签署知情同意书。

1.3 微拉伸粘接强度测试

1.3.1 NTAPP射流产生：本研究使用的NTAPP设备采用连续正弦波驱动的介质阻挡放电原理，电源输入功率为8W，峰值电压Vpp为7.0kV，频率为54.9kHz，放电气体为高纯度氦气（He），气体流量为4L/min。

1.3.2 牙本质微拉伸粘接试件的制备：60颗新鲜离体牙用慢速切割机在流水降温条件下，暴露咬合面牙本质，600目碳化硅砂纸研磨60s，预备出统一的粘接面玷污层，超声清洗5min。采用随机数字表法，根据NTAPP处理时间的不同5、10、15、20s以及是否进行老化处理随机分10组（n=6），以未预处理组作为阴性对照组。

牙本质表面用37%的磷酸凝胶酸蚀15s，流水冲洗60s，无尘纸巾吸干试件表面水分后置于NTAPP喷嘴下方3cm处，按照分组使NTAPP射流均匀喷刷牙面。使用无尘纸巾蘸取蒸馏水润湿牙面15s，湿棉球蘸干多余水分，按照Single Bond 2说明书涂布两遍粘接剂，进行常规树脂粘接。将粘接试件浸入37℃蒸馏水中24h。

1.3.3 试件老化处理及微拉伸粘接强度测试：未老化组牙齿用慢速切割机于流水冷却下顺牙齿长轴、垂直于粘接界面片切，制备用于微拉伸粘接强度测试的条状试样（0.8mm×0.8mm×8.0mm）。粘接试件分别用502胶固定于测试台上，用万能测试机（精度为0.02N）以1.0mm/min的加载速度进行测试，直至试件断裂，记录粘接界面拉断时的载荷，根据公式计算：微拉伸强度（MPa）=断裂载荷（N）/试件截面积（mm2）。将来自同一颗牙的粘接试件的粘接强度求均值作为一独立样本，然后结合同一组内来自其他牙齿粘接试件的均值一起获得每组的粘接强度均值与标准差。

老化组牙齿固定于冷热循环试验机上，在5℃和55℃环境中进行循环，每次停留60s，循环10 000次取出进行微拉伸测试，方法同前。

1.4 牙本质胶原耐次氯酸钠溶解作用的检测

1.4.1 试件制备：流水冲洗下，27颗新鲜离体牙用慢速切割机去除咬合面釉质层，截取冠部牙本质，每颗牙可制取3片1.5×1.5×6mm3大小的牙本质片，每个牙片背面刻两道刻痕以区分试件正反面。80个试件随机分为5组（n=16）。牙本质片正面酸蚀、NTAPP处理方式同1.3.2。随后各组牙本质片分别浸泡于3.5ml 5%浓度的NaClO溶液中0、30、60、120s（n=4），然后流水下冲洗4h。

1.4.2 胶原显微形貌观察：将处理后的牙本质试件，用2.5%戊二醛0.1mol/L、pH7.2的PBS固定4h，PBS冲洗3次，乙醇梯度脱水，真空干燥、喷金，在FE-SEM下观察脱矿牙本质胶原的超微结构。

1.5 统计学分析：采用SPSS 18.0统计软件，采用K-S检验证实数据符合正态分布，对实验数据进行Levene方差齐性检验后，对?TBS 进行双因素方差分析（影响因素：等离子体处理、老化处理）。对同一老化条件下?TBS进行单因素方差分析，Tukey检验进行组间两两比较。对同组老化前后的?TBS进行独立样本t检验。检验水准为α=0.05。

2  结果

2.1 微拉伸强度：各组?TBS结果见图1。等离子体和老化处理均对粘接强度有显著影响（P<0.001），且两者间交互作用显著（P<0.05）。老化前，各NTAPP处理组?TBS显著高于对照组（P<0.05），以NTAPP处理5s组粘接强度最高（55.63±1.81）MPa。老化后，NTAPP处理5和10s组?TBS稍有降低，与老化前相比差异无统计学意义（P>0.05），并显著高于其他各组（P<0.05）。老化后，对照组、NTAPP处理15、20s组?TBS显著降低（P<0.05），但15、20s组粘接强度仍显著高于对照组（P<0.05）。

2.2 NaClO溶解后各组胶原纤维形貌：由图2可见，随着NaClO处理时间延长，各组胶原纤维网均出现不同程度降解现象。对照组未经NaClO处理前，牙本质小管间、管周及小管内胶原纤维网完整（见图2A）。经NaClO处理30s后，管周和小管内部胶原纤维网仍可保持完整性，但管间胶原纤维降解（见图2B）。经NaClO处理60s后，胶原纤维降解现象加剧，仅某些小管内可见单根完整的胶原纤维（见图2C）。经NaClO处理120s后，胶原纤维完全降解，牙本质小管口开放呈较大的漏斗状，根管壁可见侧支开口（见图2D）。

NTAPP处理5、10s组经NaClO处理30s后，胶原纤维网形貌与未经NaClO处理的对照组相似，无明显改变（见图2E～F）。经NaClO处理60s后，管周和小管内胶原纤维网结构仍较完整（见图2G）。经NaClO处理120s后，胶原纤维进一步降解，未降解的胶原纤维出现断裂和卷曲现象（见图2H）。

NTAPP处理15、20s组未经NaClO处理前，小管口上方可见片状胶原凝集物（见图2I）。经NaClO处理30、60s后，管内胶原纤维断裂并显著减少，小管口仍可见片状胶原凝集物（见图2J～K）。经NaClO处理120s后，仅可观测到少量片状胶原凝集物位于小管口上方（见图2L）。

3  讨论

等离子体是继气体、液体和固体之后的第四种物质形态，是气体在高频高压电场作用下，得到的一种呈电中性并具备高电离度的气体团。包含带电粒子、各种离子、自由基、活性氧、紫外线、可见光等大量活性物质[8-9]。由于气体流温度较高，应用受限。低温常压等离子体可保持较低温，使得等离子体技术能够应用于生物医学领域。目前，NTAPP在口腔医疗领域的研究包括灭菌、修复材料表面改性、牙齿美白、牙周治疗及口腔粘接技术[10-13]。其中，灭菌及材料改性受温度影响较低，后三种研究方向因涉及到牙髓、细胞及胶原等生物组织，对NTAPP的温度累积作用异常敏感，限制了NTAPP在该领域的应用研究，亟需探索适合的放电参数。

本研究的微拉伸粘接强度测试结果显示，等离子体处理可以显著提高牙本质与全酸蚀粘接系统的即刻粘接强度，并维持较稳定的粘接持久性，这与以往研究结果基本一致[7，14-15]。其具体机制与以下方面相关：①等离子体处理可以改善牙本质表面的亲水性和润湿性，降低牙本质表面接触角，从而提高粘接剂在牙本质粘接界面的渗透性[13，16];②等离子体处理可以向胶原纤维引入羧基或羰基等官能团[7，14，17]，牙本质表面羰基含量的增加可提高胶原纤维与粘接剂之间氢键的相互作用;③羰基数目增加产生的电斥力使胶原纤维暂时脱聚成更小的纤维聚集体，甚至单个纤维，提高了粘接剂对胶原纤维的渗透[7];④等离子体的抗菌作用发挥一定功效[12]，牙体预备后残留的细菌可在牙本质粘接界面存活两年之久，经等离子体处理可降低粘接界面微生物介导的降解。

胶原耐降解结果显示，对照组经NaClO浸泡后胶原纤维的降解程度较NTAPP处理组显著，提示NTAPP处理可改善牙本质胶原纤维的强度，这可能与等离子体介导的交联作用相关。等离子体产生的紫外线可引起明胶分子间交联，并在胶原和明胶氨基酸（如酪氨酸和苯丙氨酸）的芳香残基上形成自由基[18]。其次，等离子体产生的自由基可与OH相互作用，在聚合纤维上形成羟基化合物，随后可通过氢键增加交联数量[19]。此外，等离子体中的电子也与基质相互作用，在聚合物链中形成自由基，引发聚合链中瞬间形成自由基，进而启动交联过程[20]。

NTAPP處理具有双重效用，在适宜的参数下，可有效增加牙本质粘接强度、持久性及胶原的机械强度，而处理牙本质时间过长会降低粘接强度，并改变脱矿牙本质的微观形貌。脱矿的牙本质胶原纤维会在40℃左右发生变性[21-22]，NTAPP处理15和20s可见胶原凝结成片状，提示这两组的热量累积破坏了脱矿的胶原纤维，NTAPP产生的高能粒子及气体流量对脱矿胶原也存在一定影响。这两组?TBS在老化前后的变化也印证了NTAPP的负面作用。

在适宜条件下，NTAPP处理可有效提高牙本质粘接强度，改善牙本质与全酸蚀粘接剂（Single Bond 2）的粘接持久性，增强脱矿胶原纤维耐NaClO溶解的能力。本研究中，最适宜的处理时间是5s。而NTAPP处理对牙本质胶原纤维交联作用的具体机制仍需进一步实验研究。

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[收稿日期]2021-01-26

本文引用格式：王欽鸿，王丹杨，谢娜，等.低温常压等离子体改善牙本质-全酸蚀粘接系统粘接效果的体外研究[J].中国美容医学，2021，30（7）：93-97.