牛耳枫质量标准提升研究

唐靖雯 彭政忠 潘 梅 李娇娇 杨 桃 潘 婷 王 欢

贵州威门药业股份有限公司，贵州 贵阳 550018

牛耳枫为虎皮楠科交让木属植物牛耳枫DaphniphyllumcalycinumBenth的干燥带叶茎枝，收载于《广西中药材标准》，具有清热解毒、活血舒筋的功效，分布于湖南、广东、江西等地[1-2]。主要含有黄酮类化合物及少量的生物碱、三萜类、甾醇类和酚酸类等其它化合物，其中黄酮类化合物芦丁不仅具有调节毛细血管壁的渗透性和脆性、防止血管破裂、止血的作用，还具有抗菌消炎、抗氧化等作用[3-4]。牛耳枫可治疗糖尿病、心血管疾病和高血压等多种疾病，其叶和种子中含有的生物碱具有抗肿瘤的作用[5]，种子可榨油做肥皂、润滑油等[6]。牛耳枫作为临床上常用中药，其质量真伪、优劣严重影响临床疗效，但目前只有《广西中药材标准》[7]的质量标准中仅有性状、显微鉴别，缺少具有代表性的薄层鉴别和含量测定，不够全面反映牛耳枫药材的内在质量，达不到判断质量优劣的目的。因此本研究在牛耳枫的性状、显微鉴别的基础上增加薄层鉴别、含量测定，并考察了水分、总灰分和浸出物，以更有效地鉴定牛耳枫药材质量，为牛耳枫药材的进一步开发应用提供鉴定依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 高效液相色谱仪Agilent-1260型(美国Agilent公司)；检测器：二极管阵列检测器；万分之一电子天平AY120型(日本岛津公司)；十万分之一电子天平AG135型(瑞士梅特勒公司)。

1.2 药品与试剂 乙腈(色谱纯，美国TEDIA天地试剂公司)；娃哈哈纯净水；水合氯醛、间苯三酚、浓盐酸、稀甘油均为分析纯；牛耳枫对照药材(批号：121660-201201)，中国食品药品检定研究院；芦丁对照品(批号：100080-201409；含量：91.9%)，中国食品药品检定研究院。

研究所用的牛耳枫药材均来源于广西、湖南和广东等地，详见表1。

表1 样品来源表

2 方法与结果

2.1 形态鉴别 主干呈类圆柱形，直径0.8～4.0 cm，切后呈斜切片，切片椭圆形，直径1.0～5.0 cm，厚0.3～1.0 cm，皮表面具皮孔，灰褐色至褐色，质坚硬，不易折断；枝呈圆柱形，直径0.3～2.0 cm，切后呈斜切片状或枝段，切片椭圆形，直径0.3～3.0 cm，厚0.2～0.8 cm，枝段直径0.3～0.5 cm，长0.5～1.5 cm，表面灰绿色或浅灰棕色，具稀疏皮孔，体轻质硬，较难折断，断面灰白色或浅棕色，髓部疏松或形成髓腔。叶片基部宽楔形，全缘；上表面草绿色至浅灰棕色，下表面浅绿色至灰棕色；叶脉下表面突起，侧脉明显；叶柄长3～8 cm，革质。偶见果实，果实卵圆形，具有不规则的皱纹。气微，味苦涩。如图1所示。

图1 牛耳枫形态鉴定(来源于广西省桂林市荔浦县)

2.2 显微鉴定 茎横切面：表皮具表皮细胞1列，外被厚角质层；有的老枝可见木栓层。皮层由数列至十余列薄壁细胞组成，内含众多草酸钙簇晶，有的薄壁细胞含黄褐色块状物。韧皮部由1～2列细胞组成韧皮射线，细胞内常见草酸钙簇晶。木质部宽广，导管类方形或多角形，多单个或 2～3个成群，木纤维胞腔较大，木射线为1～2列细胞组成。髓部薄壁细胞类圆形；中央多成空隙。叶表面观：上表皮细胞垂周壁波状弯曲，部分细胞含草酸钙簇晶，常并列或成群分布。下表皮细胞垂周壁较平直，乳头状突起呈小圆圈状，气孔平轴式；草酸钙簇晶较多，常并列或成群分布。粉末：粉末灰褐色或黄灰色。内含草酸钙簇晶较多，直径10～30 μm，大多存在于细胞内。石细胞类圆形或类长多角形，胞腔内含红棕色内含物。导管多为螺纹导管和梯纹导管，直径23～45 μm。纤维束狭长，长短不一。粉末中偶有破碎的细胞块，如叶下表皮细胞垂周壁较平直，乳头状突起呈小圆圈状，气孔平轴式。如图2所示。

图2 牛耳枫显微鉴定

2.3 薄层鉴别 取牛耳枫粉末1 g，加甲醇25 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇 1 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取牛耳枫对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液；再取芦丁对照品，加甲醇制成每1 mL含1.0 mg的溶液，作为对照品溶液。按2015年版《中国药典》四部通则0502薄层色谱法试验，吸取上述3种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯365 nm下检视，结果如图3所示。在供试品、对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

图3 牛耳枫TLC色谱图

2.4 检查项及浸出物 采用2015年版《中国药典》四部通则0832水分测定法第二法(烘干法)测定含水量，通则2302灰分测定法测定总灰分，通则2201项下醇溶性浸出物测定法(热浸法)测定浸出物含量(溶剂：稀乙醇)，平行3份，结果见表2。根据测定的结果，初步拟定含水量不超过11.0%，总灰分含有量不得超过5.0%，浸出物含有量不得少于14.0%。

2.5 含量测定

2.5.1 色谱条件 色谱柱：Agilent TC-C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液(54∶46，V/V)；流速：1.0 mL/min；检测波长：354 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL；理论板数按芦丁峰计算应不低于3000。

2.5.2 溶液制备 对照品溶液的制备：取芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液，即得。供试品溶液的制备：取本品粉末(过二号筛)约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.5.3 系统适用性试验 分别精密吸取“2.5.2”项下芦丁对照品溶液、供试品溶液及缺牛耳枫药材的阴性空白溶液按“2.5.1”项下色谱条件进行测定，分离度R=1.8，理论塔板数为5500。色谱如图4所示。

表2 水分、总灰分、浸出物含有量测定结果 (n=3)

图4 芦丁HPLC色谱图

2.5.4 线性关系 精密吸取芦丁对照品贮备液(200.34 μg/mL) 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，分别置10 mL的量瓶中，用甲醇稀释至刻度，分别进样10 μL，按“2.5.1”项下色谱条件，各进样10 μL， 记录峰面积。以对照品的质量数为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。回归方程：A=1696.9C-21.296，r=0.9996。结果表明，芦丁在0.200～1.403 μg范围内，其质量数与峰面积呈良好的线性关系。

2.5.5 精密度试验 精密吸取芦丁对照品溶液(80.2 μg/mL) 10 μL，重复进样6次，按“2.5.1”项下色谱条件测定其峰面积。结果RSD为1.17%，表明仪器精密度较好。

2.5.6 稳定性试验 取牛耳枫药材按“2.5.2”项下法制成供试品溶液，“2.5.1”项下色谱条件分别于0、3、6、9、15、24 h测定其峰面积。结果，芦丁峰面积的RSD为0.41%，说明牛耳枫药材供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.7 重复性试验 分别精密称取牛耳枫药材粉末(药材编号：Y063-15-11-24-01)6份，按 “2.5.2”项下法制成供试品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件进行测定，以外表一点法计算芦丁含量。结果，芦丁含量的RSD为1.47%，表明该方法的重复性良好。

2.5.8 加样回收率试验 分别精密称取9份已知含量的牛耳枫药材粉末(过二号筛) (药材编号：Y063-15-11-24-01) 1 g，置于具塞锥形瓶中，按芦丁对照品与牛耳枫药材中芦丁含量1.5∶1、1∶1、0.5∶1加入芦丁对照品，按“2.5.2”项下法制成供试品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件进行测定。结果：牛耳枫药材中芦丁平均回收率为101.65%，RSD为2.42%，说明该方法可用于测定牛耳枫药材中芦丁的含量，结果详见表3。

表3 芦丁加样回收率试验结果

2.5.9 样品含量测定 取20批不同产地牛耳枫药材，按“2.5.2”项下法制成供试品溶液和按“2.5.1”项下色谱条件进行测定其峰面积。以干燥品计算牛耳枫药材中芦丁的含量(%)。结果详见表4。根据测定的结果，初步拟定芦丁含量不得低于0.07%。

表4 不同产地牛耳枫药材芦丁含量测定

3 讨论

3.1 指标性成分的确定 牛耳枫主要成分为黄酮类、酚酸类和生物碱类。据文献报道[8]，从牛耳枫枝干和叶中分离可得到羽扇豆酮、β-谷甾醇、胡萝卜苷、deoxycalyciphylline B、daphiodhanins D、calyciphylline B、槲皮素、芦丁等化合物，其芦丁是牛耳枫中主要的黄酮类成分；因此，本研究以芦丁作为指标进行含量测定。

3.2 展开剂的考察 本研究以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G板为载体，5%三氯化铝乙醇溶液为显色剂，曾采用乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液(20∶5∶1)[9]、甲苯(水饱和)-甲酸乙酯-甲酸(4∶4∶2)[10]作为展开剂进行研究，但因斑点不清晰，且存在拖尾现象；因此，研究中调整了展开剂及比例，分别以丙酮-乙酸-水(9∶1∶1)、丙酮-甲酸-水(10∶1∶1)、乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)为展开剂进行考察研究，结果表明：以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)为展开剂，斑点清晰，分离度好。

3.3 TLC法耐用性考察 本研究考察了温度(25 ℃、4 ℃)、相对湿度(75%、52%) 、厂家、薄层硅胶板(G型、H型)对芦丁TLC鉴别的影响，发现各厂家G 型硅胶板在不同温度、相对湿度下，TLC 色谱图中芦丁斑点清晰，与相邻斑点分离度较好，而H 型硅胶板效果较差，故选择G 型板。

3.4 HPLC法耐用性考察 本研究考察了色谱柱[Ultimate XB-C18(250×4.6 mm)、Diamonsil C18(250×4.6 mm，5 μm)、Agilent TC-C18(2) (250×4.6 mm，5 μm)]，柱温(25 ℃、30 ℃、40 ℃)，流动相比例[乙腈-0.1%磷酸(16∶84)、乙腈-0.1%磷酸(15∶85)、乙腈-0.11%磷酸(14∶86)]，流速(0.9 mL/min、1.0 mL/min、1.1 mL/min)，考察发现流动相比例和流速的改变对芦丁的检测影响较大。

4 结论

本研究通过对牛耳枫水分、灰分、浸出物的测定，为制订牛耳枫药材质量标准提供实验依据；对牛耳枫显微鉴别、薄层鉴别、含量测定进行较为全面的研究，建立专属性强的定性、定量测定方法，能够准确、科学地评价牛耳枫质量，也为相关地方标准的制定以及现有质量标准的提升提供参考。