基于连续分类策略的饲用鱼油掺假陆生动物油脂红外光谱鉴别分析

高 冰，徐 帅，韩鲁佳，刘 贤

中国农业大学工学院，北京 100083

引 言

农业部第1773号公告《饲料原料目录》将动物油脂列入了饲料原料目录，作为饲料中重要的能量物质被广泛添加在各类畜禽饲料中[1]。目前，市场上常见的饲用动物油脂为鱼油、 猪脂、 牛脂和家禽油脂。其中鱼油的营养价值高、 产量低、 提炼工艺复杂[2]，因此鱼油的价格高于其他饲用动物油脂。受利益驱使，市面上鱼油的掺伪现象严重，其中陆生动物油脂是鱼油中常见的掺假物质[3]。饲用鱼油掺伪陆生动物油脂的行为不仅扰乱市场，严重损害消费者的权益，反刍动物油脂掺假更可能导致“疯牛病”随着养殖环节传播[4]。

目前，国内外常用的油脂掺伪检测技术为基于脂肪酸组分检测的气相色谱法[5]。该方法虽能对样品化学组分进行直接检测，但操作费时费力，对操作人员有严格的技术要求，不适合大样本量的检测[6]。与之相比，光谱法具有无需样品预处理、 兼顾检测精度与检测效率等优点，符合现阶段产业的需求。有研究表明，光谱法可以运用于鱼油的掺假鉴别[7]。Bellorini等利用FTIR光谱技术检测鱼油中的牛脂掺假[8]； Rohman等利用光谱法鉴别鱼肝油中的猪脂、 牛脂和羊脂的掺假[9]； Xu等开展了鱼油中单类别陆生动物油脂掺假红外光谱判别分析的可行性研究，并探讨了鱼油中陆生动物油脂的检出限[10]。以上研究均对鱼油与掺假陆生动物油脂鱼油之间进行单类别判别分析，并未对多类别判别的可行性与效果进行探讨。

多类别判别分析方法广泛应用于油脂[11]、 饲料[12]、 葡萄酒[13]等食品的真实性和掺假研究。与多类别判别分析方法可以确证特定的掺假物不同，单类别判别分析只能筛查样本是否为掺假样本[14]。因此，单类别判别分析模型常应用于大样本量的快速筛选[15]。

本研究提出一种连续分类策略(单类别判别分析筛查+多类别判别分析确证)探究饲用鱼油中掺假陆生动物油脂的红外光谱鉴别分析潜力。

1 实验部分

1.1 动物油脂样品的收集与制备

供试动物油脂样品共50个，包括鱼油12个、 猪脂10个、 鸡油9个、 牛脂10个和羊脂9个，收集自全国不同的饲用油脂企业。样品均经聚合酶链式反应技术检测，无交叉污染。

采用均匀混合法进行饲用鱼油中掺加陆生动物油脂的样品制备，获得掺假猪脂的鱼油样品40个，猪脂含量(W/W)范围： 2.9%～49.4%； 掺假鸡油的鱼油样品40个，鸡油含量(W/W)范围： 3.1%～51.3%； 掺假牛脂的鱼油样品40个，牛脂含量(W/W)范围： 2.8%～50.6%； 掺假羊脂的鱼油样品40个，羊脂含量(W/W)范围： 2.9%～50.3%。样品总计160个。

1.2 红外光谱数据分析

红外光谱仪Perkin Elmer FTIR Spectrum 400(美国Perkin Elmer公司)，采用衰减全反射附件。光谱采集范围为4 000～550 cm-1，分辨率4 cm-1，扫描次数32，每个样品重复扫描3次取平均光谱。使用SNV，Smoothing，Autoscale等方法预处理光谱数据。

1.3 分析方法

采用主成分分析(PCA)进行光谱数据分类探索性分析。采用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)进行定性判别分析。所用软件为Matlab(R2015a，美国Mathworks公司)。采用残差统计剔除异常值，置信区间设为95%。为防止过拟合，使用“leave one out”法进行交互验证[16]。通过Hotelling T2和Q残差值进行异常样本的剔除。以识别率、 拒绝率和误判率作为判别模型的评价指标，其中识别率和拒绝率越接近1，误判率越接近0，说明判别分析效果越好[17]。

2 结果与讨论

2.1 主成分分析

采用PCA对光谱数据进行探索性分析，如图1所示，前两个主成分分别占总变异系数的62.54%和12.41%。可以看出，纯鱼油和掺假陆生动物油脂鱼油之间得到了较好的区分，不存在相互混杂的样品； 掺假反刍动物油脂的鱼油样品主要分布在第二主成分的正方向，牛脂和羊脂掺假样品相互混杂，区分效果差； 掺假非反刍动物油脂的鱼油样品主要分布在第二主成分的负方向，同样可以看到猪脂和鸡油掺假样品相互混杂，区分效果差； 反刍动物油脂掺假样品和非反刍动物油脂掺假样品之间虽有少量的重叠，总体上区分较为明显。

2.2 单类别掺假鱼油判别分析

建立鱼油中是否掺假陆生动物油脂的单类别PLS-DA判别模型，图2为掺假陆生动物油脂鱼油单类别预测结果。结果表明，纯样品和掺假样品的识别率和拒绝率均为100.00%。OC-PLS分析结果同样表明纯样品和掺假样品的识别率和拒绝率均为100.00%。说明中红外光谱技术可以准确判别纯鱼油和掺假陆生动物油脂鱼油，可作为快速工具应用于鱼油样品是否掺假陆生动物油脂的筛查。

图1 基于纯鱼油和掺假陆生动物油脂鱼油红外光谱的主成分得分图

图2 单类别PLS-DA判别模型结果Fig.2 Results of PLS-DA one-class model

2.3 多类别掺假鱼油判别分析

为了进一步确证掺假陆生动物油脂的种属源，建立鱼油中是否掺假陆生动物油脂的多类别PLS-DA判别模型： 按照猪脂掺假、 鸡油掺假、 牛脂掺假和羊脂掺假划分类别建立判别1模型； 按照非反刍动物油脂掺假和反刍动物油脂掺假划分类别建立判别2模型。模型结果如表1、 表2所示。

判别1和判别2结果均表明，纯鱼油样品的不确定性分类样品比率为0.00%，识别率和拒绝率均为100.00%，这一结果与单类别判别模型结果相同。图3(a)和图3(f)的判别线将纯鱼油样品和掺假陆生动物油脂样品成功区分，未出现混杂样品。

对判别1的结果进行分析，牛脂、 猪脂、 羊脂和鸡油掺假样品的不确定性分类比率依次降低，分别为43.59%，30.00%，20.08%和15.38%(表1)； 整体的识别率和拒绝率在82.10%和92.30%(表1)之间； 其中鸡油掺假样品的拒绝率和识别率最高，误判率为7.70%(表1)，不确定分类样品比率最低，判别效果最优。图3(b)中掺假猪脂样品有多个样品并未正确分类，且少量鸡油掺假样品和牛脂掺假样品被判定为猪脂掺假样品； 图3(c)中部分猪脂掺假样品被误判为鸡油掺假样品； 图3(d)和图3(e)为掺假牛脂和掺假羊脂样品的判别1预测结果，牛脂掺假和羊脂掺假样品相互误判现象明显。上述讨论表明，猪脂掺假样品和鸡油掺假样品互为主要的误判样品来源，牛脂掺假样品和羊脂掺假样品同样相互混杂现象严重，此分析与PCA结果一致。

表1 鱼油掺假陆生动物油脂种属PLS-DA多类别判别1预测结果Table 1 Results of first PLS-DA multi-class predictions

表2 鱼油掺假陆生动物油脂种属PLS-DA多类别判别2预测结果Table 2 Results of second PLS-DA multi-class predictions

图3 多类别PLS-DA判别模型结果(a): 纯鱼油判别1结果； (b): 猪脂掺假判别1结果； (c): 鸡油掺假判别1结果； (d): 牛脂掺假判别1结果；(e): 羊脂掺假判别1结果； (f): 纯鱼油判别2结果； (g): 非反刍动物油脂掺假判别2结果； (h): 反刍动物油脂掺假判别2结果Fig.3 Results of PLS-DA multi-class model(a)： Discrimination 1 for pure fish oil; (b)： Discrimination 1 for lard; (c)： Discrimination 1 for chicken oil; (d)： Discrimination 1 for tallow； (e)： Discrimination 1 for suet； (f)： Discrimination 2 for pure fish oil; (g)： Discrimination 2 for non-ruminant lipid; (h)： Discrimination 2 for ruminant lipid

基于上述分析，重新划分判别类别，判别2的结果表明，掺假陆生动物油脂样品的不确定性分类比率均下降到10%以内，其中非反刍动物油脂掺假样品和反刍动物油脂掺假样品的不确定性分类比率分别为6.33%和6.41%(表2)； 整体拒绝率和识别率提升至90%以上，反刍动物油脂掺假样品的判别效果较优，识别率和拒绝率分别为97.40%和96.70%(表2)，误判率为2.90%(表2)。图3(g)和图3(h)所示的掺假非反刍和反刍动物油脂鱼油的判别2预测结果表明，掺假反刍和非反刍动物油脂掺假样品之间的混杂样品较少，这一结果同样与PCA结果基本一致。

结果表明PLS-DA结合中红外光谱技术可以判别纯鱼油和多类别陆生动物油脂掺假鱼油，可应用于鱼油样品掺假陆生动物油脂种属源的确证分析。

3 结 论

一种快速筛查结合确证分析的连续分类策略应用于鱼油掺假陆生动物油脂的检测。中红外光谱技术结合化学计量学可以筛分纯鱼油和掺假陆生动物油脂鱼油，识别率和拒绝率均为100.00%，所建立的多类别判别模型可以进一步确证掺假陆生动物种属源，拒绝率和识别率均达到82.00%以上，其中鸡油掺假样品和反刍动物油脂掺假样品判别效果最优。该方法作为一种快速筛查与确证分析工具可满足大样本量鱼油中陆生动物油脂掺假的检测需求。