基于ITS序列的百香果宿根连作根际土壤真菌群落变化研究

陈丽珊 周红艳 翁佩莹 范凯 李兆伟 林伟伟

摘 要：以不同宿根年限百香果根際土壤为研究材料，运用ITS序列测序技术，揭示宿根连作对百香果根际土壤微生物群落结构变化的影响。结果表明：宿根连作百香果根际土壤共测得513420条有效序列，其中注释为5346个操作分类单元（Operational Taxonomic Units， OTUs）。α多样性指数表明，百香果根际土壤真菌群落的Chao1指数、Observed species指数、Simpson指数和Shannon指数随宿根连作年份增加而下降。β多样性指数表明，根际土壤正茬与重茬之间真菌群落多样性差异比较大。在属水平的优势真菌热图分析表明，宿根连作百香果根际土壤真菌群落结构有一定差异，随着百香果宿根年限增加，柱孢属Cylindrocarpon和炭疽菌属Colletotrichum的相对丰度呈上升趋势;与之相反，被孢霉属Mortierella、木霉菌属Trichoderma和小不整球壳属Plectosphaerella随宿根年限增加而下降;其中，与有益真菌相关的被孢霉属Mortierella相对丰度随宿根年限增加而减少81.64%，而柱孢属Cylindrocarpon和炭疽菌属Colletotrichum的相对丰度随之增加了78.57%和78.05%。因此，百香果连作障碍可能是由根际土壤生态系失衡导致。

关键词：百香果;宿根连作;根际土壤;微生物多样性;高通量测序技术

中图分类号：S 344.2   文献标志码：A   文章编号：0253-2301（2021）05-0016-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.05.004

Analysis on the Changes of Fungal Community in Rhizosphere Soil of Passiflora Eduliaby Continuous Cropping of Perennial Roots Based on ITS Sequences

CHEN Li-shan1， ZHOU Hong-yan1， WENG Pei-ying2， FAN Kai2， LI Zhao-wei3， LIN Wei-wei3*

（1. Fujian Vocational College of Agriculture， Fuzhou， Fujian 350119， China; 2. College of Agriculture，

Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China; 3. College of Life Sciences，

Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China）

Abstract： By taking the rhizosphere soil of Passiflora edulia with different perennial root years as the research material， the effects of continuously ratooning on the structural changes of microbial communities in the rhizosphere soil of Passiflora edulia were revealed by using the ITS sequencing technology. The results showed that a total of 513420 effective sequences were measured in the rhizosphere soil of Passiflora edulia， among which 5346 Operational Taxonomic Units were annotated. The α diversity index showed that the Chao1 index， Observed species index， Simpson index and Shannon index of fungal communities in the rhizosphere soil of Passiflora edulia decreased with the year increase of continuous ratooning. The β-diversity index showed that the diversity of fungal communities in the rhizosphere soil was significantly different between the main crop in crop rotation and the continuous cropping. Through the heatmap analysis of dominant fungi at the genus level， there were some differences in the structures of fungal community in the rhizosphere soil of Passiflora edulia with continuously ratooning. With the year increase of perennial roots of Passiflora edulia， the relative abundance of Cylindrocarpon and Colletotrichum showed an increasing trend， while the relative abundance of Mortierella， Trichoderma and Plectosphaerella decreased with the year increase of perennial roots. Among them， the relative abundance of Mortierella related to beneficial fungi decreased by 81.64% with the year increase of perennial roots， while the relative abundance of Cylindrocarpon and Colletotrichum increased by 78.57% and 78.05%. Therefore， the obstacle for the continuous ratooning of Passiflora edulia might be caused by the ecological unbalance of the rhizosphere soil.

Key words： Passiflora edulia;Continuous cropping of perennial roots;Rhizosphere soil;Microbial diversity;High-throughput sequencing technology

百香果学名西番莲Passifloraedulia Sims是西番莲属草质藤本植物，广泛种植于热带和亚热带地区[1]。百香果作为我国重要经济作物，近年来在我国广东、海南、福建、云南、台湾等地进行大面积人工栽培，其中福建省百香果面积占据全国比重较大。百果香富含人体所需的氨基酸及维生素，具有良好的保健功能，且能排毒清热、养颜抗衰老，深受消费者的喜爱。随着人们对生活质量要求的提高以及对健康认识的增强，对具有保健功能的百香果的需求也在逐年增加。为满足广大消费者的需求，农民进行了大面积单一化种植栽培，同时长期大量使用化肥，导致土壤酸化，出现了连作障碍现象，进而使百香果的产量和品质下降[2-3]。

前人研究表明，有关植物连作障碍有诸多因素，但其根本原因是土壤理化性质恶化、营养状况衰竭、土壤微生物种群失衡、有益真菌减少、各种致病真菌和土传病害的富集[4-7]。近年来，国内外同行一直关注土壤根际研究领域，以探讨根际对话过程及其对植物-土壤-微生物相互作用的调控机制，研究的主要内容包括植物长期连作后土壤微生物生态系统失衡和微生物种群发生变化，进而导致植物的生长受阻问题。前人研究发现，连作百香果各项生理指标和光合作用下降，土壤自毒潜力增强，pH值降低，土壤酸化加剧，土壤微生从细菌型转向真菌型，更有利于致病菌生存，最终导致百香果病虫害增加、产量和质量下降[8-9]。然而，从“土壤-微生物-根际”角度研究百香果连作障碍形成的根际生态机制研究尚未见相关报道。

因此，本研究运用ITS序列测序技术对百香果宿根连作障碍根际土壤中的真菌进行分析，旨在发现宿根连作百香果根际土壤微生物的群落结构变化规律，以期为攻克宿根连作百香果根际土壤连作障碍的消减提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验地概况及试验设计

试验地位于福建省莆田市秀屿区东庄镇试验站（25°11″N，119°16′E），该地块土壤类型为砂壤土。试验以广泛种植的黄金百香果为供试品种，在2018年3月进行挖地后地植，保持苗间距为1.5 m×2 m。前人研究表明百香果第1年产量较高，第2年产量下降，病虫害也逐年增多[8]。因此，本试验选取宿根连作百香果根际土壤1年为正茬（HY）、2年为重茬（DY），旁边未种植田地为对照土壤（CK）。于2020年7月百香果开花期时，在3个随机设置试验地块小区里，每个试验地按照五点取样法采集根际土壤，每个样品重复3次，并用1 mm的孔径筛子筛出土壤中的杂质，土壤保存在-80°C备用。

1.2 根际土壤DNA提取

使用杭州博日科技有限公司生产试剂盒，并按说明书步骤提取土壤DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测质量。

1.3 真菌ITS1区PCR扩增及测序

真菌引物采用ITS1（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2（5′-TGCGTTCTTCATCGATGC-3′）对真菌的ITS1区进行PCR扩增，PCR反应体系和条件参考文献[10]。

1.4 数据分析

首先对原始数据进行筛选，如果序列短于200 bp，质量分数低于20，碱基不明确或引物序列不完全匹配则不考虑该序列。然后使用QIIME对数据集进行分析[7]。利用Mothur软件（version 1.31.2）进行α 多样分析，用OTU信息进行聚类分析和主成分分析[8-9]，并利用tayc系数计算每个样品中微生物群落之间的进化距离和聚类分析，描述多个样品之间的差异性和相似性[10]。为了比较不同样本中群落组成和结构，使用Mothur生成了前20個OTU的热图。

2 结果分析

2.1 宿根连作百香果根际土壤真菌OUT的组成和结构分析

通过测序平台IonS5TMXL在同一区域选取3个不同百香果宿根年限的根际土壤进行测序，本研究总共获得有效序列513420，97%相似序列的有效序OUT为5346，其中CK平均值为720个OTU，HY 平均值为588个OTU，DY平均值为473个OTU，由图1可知，OUT的序列条数逐渐达到3000左右，曲线达高点后开始慢慢趋向平稳，说明测序数据量合理。由图2可以看出宿根连作百香果根际土壤真菌群落OTU组成的差异性，结果表明，在OTU水平上，CK中真菌OTU占总OTU序列数的分别21.75%（305），HY中真菌OTU占9.97%（141），DY 中真菌OTU占7.14%（101）。此外，CK与HY共有的OTU数量为671（47.45%），CK与DY共有的OTU数量为541（38.26%），HY与DY共有的OTU数量为92（6.51%），CK、HY和DY的根际土壤中共有的真菌OTU数量为547（38.68%）。

2.2 宿根连作百香果根际土壤真菌群落结构分析

对宿根连作百香果根际土壤真菌群落多样性指数和物种丰富度进行分析，由表1可知，Chao1指数、Shannon指数和Observed species指数在CK、HY以及DY中呈现了逐渐下降的趋势，且都有显著性差异。其中CK最高，HY次之，DY最低。但是Simpson指数在HY、DY和CK之间并没有显著性差异。

2.3 宿根连作百香果根际土壤真菌未加权unifrac热图和主成分分析

由图3可知，CK和HY真菌群落结构聚集为一群体，然后再与DY聚集在一起，说明DY与CK和HY的根际土壤真菌存在较大差异（图3）。进一步分析宿根连作百香果根际土壤真菌群落相关主成分1（PC1）与主成分2（PC2）两者分别解释方差变量的63.37%和23.79%，其中CK、HY和DY的根际微生物虽然分布在不同区间中，但是CK和HY样品根际土壤的真菌群落组更接近（图4）。

2.5 宿根连作百香果根际土壤真菌群落组成及結构变化分析

由表2可知，在属水平上，被孢霉属Mortierella、小不整球壳属Plectosphaerella、弯孢霉属Curvularia、支顶孢属Acremonium、木霉菌属Trichoderma、曲霉菌属Aspergillus、Saitozyma属和Apiotrichum的根际土壤中HY比DY差异显著提高，而除青霉菌属Penicillium和珊瑚菌属Corallomycetella之间差异不显著。其中柱孢属Cylindrocarpon、炭疽菌属Colletotrichum、念珠菌属Colletotrichum、毛双孢属Lasiodiplodia、脆柄菇属Psathyrella和假霉样真菌属Pseudallescheria的根际土壤中，相比HY和CK而言DY的差异显著提高。由图5可知，宿根连作百香果根际土壤中前20个属水平真菌群落结构发生显著性变化。

3 讨论

靠近植物根部周围的土壤区域叫做根际土。根际土壤生态系统是由植物-土壤-微生物三者有机结合，其在植物与环境相互作用过程中发挥着重要功能，并与连作障碍的产生有密切联系，目前国内外研究学者普遍认为连作障碍产生的主要原因为土壤根际分泌物引起微生态系统失衡，进而导致土壤营养成分发生变化。

因此，本研究采用ITS 序列测序技术进行分析，结果表明随百香果宿根年限增加，根际土壤真菌群落多样性指数逐渐降低，但Simpson指数在HY、DY和CK均没有显著差异（表1）。本研究获得的结果与徐红梅等[15]的研究结果相似，即随着杭白芍连作年限的增加，根际土壤真菌群落多样性相对丰度降低，同时也与刘伟等[16]通过高通量分析方法获得的结果相一致。在本研究中，随宿根连作年限增加，根际土壤中柱孢属Cylindrocarpon、炭疽菌属Colletotrichum、念珠菌属Colletotrichum、毛双孢属Lasiodiplodia、脆柄菇属Psathyrella和假霉样真菌属Pseudallescheria相对丰度呈增加趋势，其中炭疽菌属Colletotrichum和柱孢属Cylindrocarpon的相对丰度增加了78.57%和78.05%，且HY与DY差异显著。由此看出，百香果宿根连作后土壤中病原真菌种群数量增加，这种问题可能与根系分泌间接促进原菌的生长加剧百香果宿根连作障碍有关。这与前人研究结果一致，随着连作年限的增加，三七和丹参连作会导致土壤中的致病真菌柱孢属和炭疽菌属相对丰度增加[16-18]。在本研究中，随着百香果宿根连作年限增加，根际土壤中被孢霉属Mortierella、小不整球壳属Plectosphaerella、弯孢霉属Curvularia、支顶孢属Acremonium、木霉菌属Trichoderma、曲霉菌属Aspergillus、Saitozyma属、Apiotrichum、青霉菌属Penicillium和珊瑚菌属Corallomycetella相对丰度呈减少趋势，其中被孢霉属相对丰度减少了81.64%，且HY与DY二者达到差异显著。被孢霉属对植物的生长发育起促进作用[17，19]，这个结果与三七连作相似[20]。

综上所述，随着百香果宿根年限增加，根际土壤中群落微生物多样性降低和真菌微生态失衡，引起营养循环受阻，进而使有益拮抗真菌减少以及病原真菌增多，导致抗疫病能力下降，本研究认为百香果连作障碍的产生是根际微生态系统内各种因素相互作用、相互影响的综合结果。

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（责任编辑：柯文辉）

收稿日期：2021-04-11

作者简介：陈丽珊，女，1987年生，研究实习员，主要从事农业生态学与生态补偿研究。

通信作者：林伟伟，男，1984年生，博士研究生在读，主要从事植物连作障碍及其减灾措施（E-mail：linweiwei884477@163.com）。

基金项目：国家自然科学基金项目（31500443）;莆田市秀屿区东庄镇生态农场建设项目（KH190132A）。