丁香酚微乳对鸽源金黄色葡萄球菌临床分离耐药株抗生素增敏作用的研究

赵 昕，魏思敏，刘 敏，李洋静，陶 娅，刘明江，柏若楠，李金贵*

丁香酚微乳对鸽源金黄色葡萄球菌临床分离耐药株抗生素增敏作用的研究

赵 昕1,2，魏思敏1,2，刘 敏3，李洋静4，陶 娅1,2，刘明江1,2，柏若楠1,2，李金贵1,2*

(1. 扬州大学兽医学院，扬州 225009；2. 江苏省动物重要疫病与人畜共患病防控协同创新中心，扬州 225009；3. 江苏省威特凯鸽业有限公司，无锡 214410；4.江苏省常熟市沙家浜动物防疫站，常熟 215500)

为探讨丁香酚微乳（Eugenol microemulsion，Em）对鸽源金黄色葡萄球菌（）临床分离耐药株的抗菌活性及与抗生素联合的作用效果。采用MALDI质谱分析法鉴定从病鸽分离的菌株类别，以ATCC29213为质控菌株，微量肉汤稀释法测定Em和6种抗生素对临床分离株的最低抑菌浓度（MICs），微量棋盘稀释法测定Em与6种抗生素联合作用的分级抑菌浓度指数（FICI），以平板计数法检测Em及其联合多西环素（doxycycline，DOX）对临床分离耐药株生长的抑制作用。检测结果表明，分离自病鸽心脏的（200113-J-H）为环丙沙星（CIP）、黏菌素（COL）、DOX和土霉素（OXY）的多重耐药菌株；Em对该菌的MIC为0.25%，与DOX、OXY、COL和CIP联合作用时均呈现协同作用（FICI=0.125～0.281），其中对DOX的增敏作用最明显，可使其MIC降低16倍；与ENR联合则表现为相加作用（FICI=0.561）。此外，从病鸽肝脏分离的（200113-J-L5）为四环素类DOX和OXY耐药菌株；沙门菌（200113-JH）CIP、恩诺沙星（ENR）、卡那霉素（KAN）、COL、DOX和OXY的敏感株，Em对这两种菌的MIC均为0.031 25%。结论表明，Em对耐药菌和非耐药菌均具有显著的抑菌活性，有望成为抗生素替代药物，且可显著增强多重耐药菌对抗生素的敏感性，这为鸽场细菌性疾病的控制提供了参考。

丁香酚微乳；鸽；抗生素；耐药金黄色葡萄球菌

近年来我国鸽养殖业迅速发展，随着饲养总量、饲养密度和饲养方式的改变，养鸽业逐渐走向规模化和集约化，但鸽细菌性疾病的发生也日益突出，成为制约养鸽业经济效益的主要因素之一[1-2]。抗生素常用于细菌性疾病的预防和治疗，不可避免地导致耐药菌的产生和肉蛋产品药物残留等问题，甚至威胁食品安全及人类健康[3]。然而，新型抗菌药的研发存在速度慢和难度大等问题，使人类进入了后抗生素时代。因此，寻找有效的抗生素替代药物或抗生素增敏药物迫在眉睫[4]。与抗生素相比，中药具有广谱抗菌、活性成分多、不易产生耐药性且毒副作用小等优点，成为潜在的新型抗菌药[5]。

丁香油源于桃金娘科植物丁香干燥花蕾，已被美国食品和药品管理局（FDA）认定为“安全的添加剂”，常用于口腔医疗、食品防腐添加剂、麻醉、抗菌、抗炎以抗氧化等[6-7]。研究表明，丁香油的主要化学成分为丁香酚（占比75%～90%），丁香油和丁香酚对大部分革兰氏阴性菌和阳性菌均有显著抑制作用。丁香酚（4-烯丙基-2-甲氧基苯酚）属于苯丙烷烯丙基苯类化合物，多用于食品保鲜和食品添加剂[8]。有研究表明，丁香酚对食源性致病菌有较好的抑制作用，具有广谱抗菌的特点，抗菌活性略强于丁香油[9]。但是，目前针对丁香酚与抗生素联合抑菌作用的研究相对有限，并且尚未发现鸽子感染金黄色葡萄球菌的报道。本研究从病鸽心脏分离获取并鉴定了一株多重药耐药的金黄色葡萄球菌，经研究发现丁香酚微乳对其具有显著的抑制作用，且能显著增强其对耐药抗生素的敏感性，为该菌的控制提供了参考依据，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂

丁香酚（含量 ≥ 98.5%）、无水乙醇和吐温-80（分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司；6种抗生素均购自上海吉至生化科技有限公司，包括恩诺沙星（enrofloxacin，ENR）、环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、粘菌素（colistin，COL）、土霉素（oxytetracycline，OXY）、卡那霉素（kanamycin，KAN）和多西环素（doxycycline，DOX）；细菌培养基均购于青岛高科园海博科技有限公司，按通用组方配制成Luria-Bertani（LB）液体培养基、Luria-Bertani琼脂培养基、Mueller-Hinton（MH）液体培养基以及麦康凯培养基；甲酸（质谱纯）购自Sigam有限公司；HCCA基质液购自Bruker有限公司。

1.2 仪器

DP-100CL低温恒温培养箱（中科环试，中国）；BSA223S-CW电子天平（Sartorius，德国）；MS-H280-Pro磁力搅拌机（赛恩斯，中国）；SM-650A超声破碎仪（南京舜玛，中国）；MALDI质谱分析仪（Bruker，美国）。

1.3 丁香酚微乳（Eugenol microemulsion, Em）的制备

在锥形瓶内加入一定比例的吐温-80和丁香酚油剂，在600 r·min-1，室温（25 ± 2）℃条件下，磁力搅拌器匀速搅拌均匀后，继续用移液器缓慢滴加蒸馏水，直至溶液变为均质的乳白色液体后停止搅拌。最后用超声波仪在冰浴条件下超声处理10 min，4 ℃保存备用。

1.4 试验方法

1.4.1 细菌分离 从江苏威特凯鸽业有限公司收取病鸽10对，无菌取材（肝脏、心脏和脾脏等器官），用烧红的手术剪刀烫其表面后，用高压剪刀在烫烙面剪出一个小口，再用灼烧过得接种环自剪开部位深入脏器内部，最后进行血平板划线接种。37 ℃恒温培养24 h后，挑取单个菌落接种于麦康凯琼脂平板以达到初步筛选分离大肠杆菌和沙门氏菌目的，并用LB肉汤培养基对分离的细菌进行培养传代。

1.4.2 MALDI质谱分析鉴定 挑取琼脂平板上单个菌落，均匀涂布在MALDI 靶板上，自然晾干后加入1 μL70%的甲酸水溶液，溶液晾干后再加入1 μL HCCA基质溶液，自然干燥后，放入质谱仪进行检测。

1.4.3 最小抑菌浓度（minimal inhibit concentration, MIC）的测定 参照临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）发布的标准（M100, 2019），采用96孔板微量肉汤稀释法分别测定丁香酚、丁香酚微乳及6种抗生素对临床分离株的MICs。在无菌96孔板中分别加入MH培养基和待测药品，进行连续二倍稀释，再加入100 μL 预先摇至对数生长期并稀释至每毫升1.0×105菌落总数的菌液（colony-forming unit CFU），每块96孔板设置菌液阳性对照组、MH阴性对照组和待测药物阴性对照组。37 ℃培养16～18 h后读取结果。质控菌株选用、和标准菌株，所有抗生素和培养基均在质控范围内。

1.4.4 丁香酚微乳与抗生素联合药敏试验 通过微量棋盘稀释法测定丁香酚微乳与ENR、OXY、COL、CIP、KAN和DOX这6种抗生素联合使用时的分级抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration index, FICI）来判定其相互作用。将丁香酚微乳和各抗生素参照其MICs在MH肉汤培养基内梯度稀释为 2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC和1/16MIC，于稀释后的各孔中加入预先摇至对数生长期并稀释至1.0×105CFU·mL-1的菌液，于37 ℃恒温培养箱内培养16～18 h后读取结果，以无细菌生长的最低药物浓度为联用MIC。参照下列公式计算FICI，来判定丁香酚微乳与其他抗生素联用的作用效果。

FICI判读结果如下：FICI≤0.5，协同作用；0.5＜FICI≤1，相加作用；1＜FICI≤2，无关作用；FICI＞2，拮抗作用[10]。

1.4.5 丁香酚微乳对ATCC29213标准株生长的影响 将标准株ATCC29213菌株活化后培养至对数生长期，用MH肉汤培养基稀释，调整菌液浓度至1×105CFU·mL-1，用1%接种量接种于MH培养液中，分别加入对应浓度为MIC、1/4 MIC和1/16 MIC的Em，并设置菌液阳性对照组。180 r·min-1，37 ℃培养24 h，并在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h和24 h无菌取样，采用平板计数法，将菌液逐级稀释混匀后，取对应稀释浓度菌液100 μL均匀涂布平板，37℃培养16～18 h后进行菌落计数，参照公式：

1.4.6 丁香酚微乳与DOX联合使用对临床分离株生长的影响 将分离到的200113-J-H菌株培养至对数生长期，用MH肉汤培养基稀释并调整菌液浓度至1×105CFU·mL-1，用1%接种量接种于MH培养液中，分别加入对应浓度为MIC、1/8 MIC DOX+1/8 MIC Em、1/16 MIC DOX+1/16 MIC Em和1/32 MIC DOX+1/32 MIC Em，并设置菌液阳性对照组。180 r·min-1，37 ℃培养24 h，并在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h和24 h无菌取样，采用平板计数法，将菌液逐级稀释混匀后，取对应稀释浓度菌液100 μL均匀涂布平板，37 ℃培养16～18 h后进行菌落计数。

1.4.7 统计分析 使用GraphPad Prism 8.0多重比较分析（ordinary one-way ANOVA），统计数据采用“mean ± SEM”表示，以＜0.05作为显著性，＜ 0.01为极显著判断标准。每组试验均重复3次。

2 结果与分析

2.1 细菌分离与鉴定

分离所得的3株细菌分别在血琼脂平板和LB平板上生长良好，取新鲜的单菌落进行微生物蛋白指纹图谱鉴定，如图1所示，2100113-JH鉴定为，2100113-J-L5初步鉴定为，2100113-J-H鉴定为。

图1 MALDI Biotyper微生物蛋白指纹图谱鉴定结果

Figure 1 The classification results of MALDI Biotyper microbial protein fingerprint

2.2 Em和抗生素的MIC

对已鉴定的临床分离株分别进行Em和抗生素的药敏检测，结果如表1所示。临床分离株2100113-JH对所测试的6种抗生素未表现出明显的耐药性，临床分离株2100113-J-L5分别对DOX和OXY有耐药性，临床分离株2100113-J-H对CIP、COL、DOX和OXY4种抗生素具有耐药性。丁香酚和丁香酚微乳对临床分离株均有较好的抑菌效果，尤其对两个耐药株而言，抑菌作用显著优于抗生素。

表1 丁香酚、丁香酚微乳及抗生素对3株临床分离菌株及相应质控菌株的MIC

注：“R”表示耐药。CIP：MIC ≤ 1 μg·mL-1对肠杆菌和葡萄球菌为敏感，MIC ≥ 4 μg·mL-1对肠杆菌和葡萄球菌为耐药；KAN： MIC ≤ 16 μg·mL-1对肠杆菌和葡萄球菌为敏感， MIC ≥ 64 μg·mL-1对肠杆菌和葡萄球菌为耐药；DOX： MIC ≤ 4 μg·mL-1对肠杆菌和葡萄球菌为敏感， MIC ≥ 16μg·mL-1对肠杆菌和葡萄球菌为耐药；OXY 、ENR和COL的折点没有定义（Clinical and Laboratory Standards Institute, 2017）。

表2 丁香酚微乳与抗生素联合对临床分离耐药株200113-J3-H1的效果

图2 Em对ATCC 29213标准株（a）以及Em与DOX联合对临床分离S. aureus多药耐药株（b）生长作用影响

Figure 2 Growth curve oftreated by Em (a) and of clinically isolated multi-drug resistantby Em combined with DOX（b）

2.3 Em与抗生素联合对200113-J3-H1临床耐药株分离株的FICI

使用Em联合抗生素测试临床分离耐药株200113-J-H，结果如表2所示，与Em联合使用后，抗生素使用浓度均有所降低，随着Em浓度与抗生素的MIC呈负相关，除ENR的FICI为0.516，表现为相加作用外，其余4种抗生素均为协同作用。尤以CIP和DOX效果明显。

2.4 Em对标准株ATCC29213生长的影响

如图2（a）所示，根据平板计数统计结果表明，Em对标准株有明显的抑菌作用，抑菌活性与Em剂量呈正相关，具有浓度依赖性。该结果可说明，Em对菌株有明显的抑制作用，且到第6小时已完全达到杀菌作用。明确Em对标准株的生长影响趋势后，结合FICI结果，采用平板计数法，分析Em与DOX联合使用对200113-J-H临床耐药分离株的生长趋势。如图2（b）所示，1/8 MIC DOX+1/8 MIC Em和1/16 MIC DOX+1/16 MIC Em对该耐药株的抑制作用明显高于1/32 MIC DOX+1/32 MIC Em，而且Em与DOX联用后，使DOX的用量降低了16倍，这说明，Em可以显著降低200113-J-H临床耐药分离株对DOX的耐药性，有助于恢复该菌株对DOX的敏感性。

3 讨论与结论

金黄色葡萄球菌是人与动物重要的致病菌之一，临床上常见的是以皮肤、粘膜等组织器官感染或关节炎、肠炎等，不及时治疗往往会引起败血症导致死亡，也是引起食物中毒常见致病菌之一[11]。本研究的病鸽表现为羽毛杂乱无光，严重者局部脱毛；眼睑周围有分泌物；腹部呈黑色；剖检发现胸腹部皮下有渗出液，肝脏和脾脏肿大，病变严重的出现坏死灶。从病鸽心脏和肝脏分离到了、以及，这些细菌的混合感染可能是造成上述病症的重要原因。

本试验用丁香酚、丁香酚微乳及多种抗生素单独或联合处理临床分离的鸽源、和，发现为多重耐药菌株，为敏感菌株，部分耐药，而丁香酚和丁香酚微乳对它们均有明显的抑菌作用，MIC为0.05%～0.25%，并具有明显的剂量依赖效应，细菌生长曲线的分析发现丁香酚微乳在2 h出现抑菌作用，6 h后开始达到杀菌效果。前期也有研究表明丁香油及丁香酚对沙门氏菌（MIC= 0.012 5%（/））、大肠杆菌（MIC=1μg·mL-1）、肺炎克雷伯菌（MIC=0.063～ 0.999 μg·mL-1）以及金黄色葡萄球菌（MIC = 0.4 μL·mL-1（/））均具有良好的抗菌活性[12-14]。与本研究结果具有相似的效果，这说明丁香酚及其微乳可有效抑制分离菌的生长。

在联合用药方面，已有研究证实丁香油与β-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素和莫匹罗星等药物联合作用的研究[15-17]。但是，与四环素类药物联用的增敏研究却鲜见报道。在本试验中，丁香酚微乳与测试的5种抗生素联合使用时，有4种表现为协同作用，1种表现为相加作用；其中丁香酚微乳与CIP和DOX联合作用效果最明显。在此基础上，结合DOX在畜禽养殖业的广泛应用，对丁香酚微乳与DOX联用效果进行观察，结果表明二者仅需1/16 MIC即有显著的抑菌效果，联合使用可使DOX用量降低16倍。

丁香酚体内使用相对比较安全，其对小鼠的LD50高达到789 mg·kg-1，仅需160 mg·kg-1即可对军团肺炎模型小鼠有很好的治疗效果[18]。但丁香酚与抗生素联用的体内抗菌活性研究罕见，还需要后续的试验证实。

综上所述，丁香酚不仅自身具有显著的抑菌作用，还可以增强四环素类药物、喹诺酮类药物的敏感性，在临床治疗过程中可考虑单独使用，也可考虑与上述抗生素联合使用，既可增强抑菌效果又能减少抗生素用量。

[1] 陈伟亮.规模化养鸽主要疫病的综合防治技术要点[J].畜牧业环境, 2020(1):51.

[2] 徐风苍. 鸽常见细菌病的防治[J].家禽科学, 2020(3): 34-35.

[3] 刘思伽, 李海华, 邱深本, 等. 肉鸽养殖业现状及发展对策[J]. 中国畜牧兽医文摘, 2012,28(12): 44.

[4] BROWN E D, WRIGHT G D. Antibacterial drug discovery in the resistance era[J]. Nature, 2016, 529(7586): 336-343.

[5] 黄梅, 谭余庆, 罗俊, 等. 植物类中药抗细菌耐药性的研究进展[J]. 中国实验方剂学杂志, 2018,24(23): 218-224.

[6] 屠寒, 江汉美, 卢金清, 等.丁香药理作用研究进展[J].香料香精化妆品, 2015 (5) :59-62.

[7] XU J G, LIU T, HU Q P, et al. Chemical composition, antibacterial properties and mechanism of action of essential oil from clove buds against[J]. Molecules, 2016, 21(9): 1194.

[8] ÖZCAN M M, ARSLAN D. Antioxidant effect of essential oils of rosemary, clove and cinnamon on hazelnut and poppy oils[J]. Food Chem , 2011, 129(1): 171-174.

[9] 曾荣,陈金印,林丽超.丁香精油及丁香酚对食品腐败菌的抑菌活性研究[J].江西农业大学学报, 2013, 35(4): 852-857.

[10] ALEXOPOULOS A, KIMBARIS A C, PLESSAS S, et al. Combined action of piperitenone epoxide and antibiotics against clinical isolates ofand[J]. Front Microbiol, 2019, 10: 2607.

[11] 罗永乾. 动物源大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌耐药表型与氯霉素类抗菌药物耐药基因型的研究[D]. 重庆: 西南大学, 2017.

[12] CAMPANIELLO D, CORBO M R, SINIGAGLIA M. Antifungal activity of eugenol against penicillium, aspergillus, andspecies[J]. J Food Prot, 2010, 73(6): 1124-1128.

[13] DE OLIVEIRA PEREIRA F, MENDES J M, DE OLIVEIRA LIMA E. Investigation on mechanism of antifungal activity of eugenol against[J]. Med Mycol, 2013, 51(5): 507-513.

[14] [14] DHARA L, TRIPATHI A. Antimicrobial activity of eugenol and cinnamaldehyde against extended spectrum beta lactamase producingby inand molecular docking analysis[J]. Eur J Integr Med , 2013, 5(6): 527-536.

[15] 邱敏, 龙娜娜, 高鸣乡, 等. 丁香油联用β-内酰胺类抗生素体外抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌作用研究[J]. 中草药, 2019,50(7):1629-1635.

[16] KWIATKOWSKI P, PRUSS A, GRYGORCEWICZ B, et al. Preliminary study on the antibacterial activity of essential oils alone and in combination with gentamicin against extended-spectrum β-lactamase-producing and new Delhi metallo-β-lactamase-1-producingisolates[J]. Microb Drug Resist, 2018, 24(9): 1368-1375.

[17] BUDZYŃSKA A, RÓŻALSKA S, SADOWSKA B, et al./dual-species biofilm as a target for the combination of essential oils and fluconazole or mupirocin[J]. Mycopathologia, 2017, 182(11/12): 989-995.

[18] 马江伟. 丁香酚及肉桂醛对嗜肺军团菌的抗菌作用及机制的研究[D]. 沈阳: 中国医科大学, 2018.

Study on sensitization effect of Eugenol microemulsion on antibiotics of clinically isolated resistant strains offrom pigeon

ZHAO Xin1,2, WEI Simin1,2, LIU Min3, LI Yangjing4, TAO Ya1,2, LIU Mingjiang1,2, BO Ruonan1,2, LI Jingui1,2

(1. Department of Clinical Veterinary Medicine, School of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009; 2. Jiangsu Co-Innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009; 3. Jiangsu Weikaite Pigeon Industry Co.,Ltd., Wuxi 214410;4.Shajiabang Animal Epidemic Prevention Station, Changshu 215500)

To investigate the antibacterial activity of Eugenol micro-emulsion (Em) and the effect of Em combined with antibiotics against clinically isolated drug-resistant strains offrom pigeon. The strains isolated from diseased pigeons were identified by MALDI mass spectrometry. The minimal inhibitory concentration (MIC) of Em and six kinds of antibiotics to clinical isolates were determined by microbroth dilution method with ATCC29213 as quality control strain. Micro-chessboard dilution method was used to determine the graded inhibitory concentration index (FICI) of the combined action of Em and six kinds of antibiotics. Plate counting method was used to detect the inhibitory effect of Em and its combination with doxycycline (DOX) on the growth cruve of clinically isolatedresistant strains. The results showed that() isolated from the heart of diseased pigeons was multiple drug resistant strains of ciprofloxacin (CIP), colistin (COL), doxycycline (DOX) and oxytetracycline (OXY). The MIC of Em to this strain was 0.25%, which showed a synergistic effect (FICI=0.125～ 0.281) when combined with DOX, OXY, COL and CIP, among which the sensitizing effect on DOX was the most obvious and the MIC of DOX could be reduced by 16 times. The combination with ENR showed additive effect (FICI=0.561). In addition,() isolated from the liver of diseased pigeons was DOX and OXY resistant strains.() sensitive strains of CIP, Enrofloxacin (ENR), Kanamycin (KAN), COL, DOX and OXY. The MICs of Em to both bacteria were 0.03125%. Conclusion: Em is expected to become an antibiotic replacement drug, which has significant antibacterial activity against both resistant and non-resistant bacteria. Em can significantly enhance the sensitivity ofmulti-resistant bacteria to antibiotics, simultaneously. This study provides a reference for the control of bacterial diseases in the pigeon house.

Eugenol microemulsion; pigeon; antibiotics; drug-resistant strains of

S852.611

A

1672-352X (2021)03-0418-05

10.13610/j.cnki.1672-352x.20210706.025

2021-7-7 11:50:57

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20210706.1700.050.html

2020-07-29

江阴市科技创新专项资金（JY0603A010103190010PB），现代农业科技发展项目和江苏高校优势学科建设工程共同资助。

赵 昕，硕士研究生。E-mail：zorazz@126.com

李金贵，博士，教授，博士生导师。E-mail：jgli@yzu.edu.cn