固相萃取-UPLC-MS/MS同时测定水中16种磺胺类抗生素残留

王运儒 孟祥至 秦玉燕 邓有展

摘 要：建立了固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱（SPE-UPLC-MS /MS）同时检测水中16种磺胺类抗生素的分析方法。水中的磺胺类抗生素经 HLB净化柱富集纯化后经Acquity UPLC HSS T3 柱分离，多反应监测模式（ MRM） 进行定性定量分析。流动相由乙腈和0.1 %的甲酸水溶液（V/V）组成，梯度洗脱。该方法的检出限：1.0～5.0 μg/kg;加标回收率范围：78.6 %～103.2 %;相对标准偏差范围：1.1 %～12.8 %。结果表明，该方法灵敏度高、具有良好的精密度和准确度，适用于水中 16 种磺胺类药物残留检测。

关键词：磺胺类抗生素 固相萃取 超高效液相色谱串联质谱法

中图分类号：TS201.6                    文献标志码：A

Determination of 16 Kinds of Sulfonamides Residues in Water by Solid Phase Extraction-UPLC-MS/MS

WANG Yunru1，2，3*， MENG Xiangzhi4，QIN Yuyan1，2，3*，DENG Youzhan1，2，3

（1Guangxi Subtropical Crops Research Institute， Nanning， Guangxi 530001， China;2 Laboratory of Quality Risk Assessment for Agro-products （Nanning） Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Nanning， Guangxi 530001， China;3 Quality Supervision and Testing Center of Subtropical Fruit and Vegetable，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Nanning， Guangxi 530001， China;4 Shandong Benyuan Environmental Technology Co. Ltd.，Jinan， Shandong 250100， China）

Abstract： A method was developed for simultaneous determination of 16 sulfonamides antibiotics in surface water by solid-phase extraction with ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（SPE-UPLC-MS/MS）. The sulfonamides in water was enriched and purified by HLB solid phase extraction column， and separated by Acquity UPLC HSS T3 column with a gradient elution of acetonitrile and 0. 1% formic acid （v：v）， then the qualitative and quantitative analysis was performed under the multiple reaction monitoring（MRM） mode. The detection limit was 1.0～5.0 μg/kg， recovery rate was 78.6%～103.2% and the relative standard deviations was 1.1%～12.8%. The method with high sensitivity， good precision and accuracy is suitable for detection of 16 sulfonamides residues in water.

Key words： Sulfonamide antibiotics; solid phase extraction; ultra high performance liquid chromatography tandem mass

磺胺類抗生素药物（Sulfonamides，SAs）是我国目前应用最多，使用量最大的抗生素之一，具有抗菌谱广、低成本、高稳定性和较强的亲水性等特征[1-3]。磺胺类抗生素通过干扰细菌的叶酸合成从而使细菌生长和繁殖受到抑制，被广泛用于医疗、畜牧业和水产养殖业等，属于少有的人类、畜牧和水产养殖业共同使用的药物。据统计，在2013年，SAs 在我国的使用量达到了7920 t，其中用于兽药的占76 %，用于医药的占11 %[4]。目前磺胺类抗生素污染的来源主要是药物生产过程中排放的废水、水产养殖业、畜牧业和人类医疗用药。磺胺类抗生素因具有很高的稳定性，在环境中降解速度慢，人畜服用后磺胺类药物后大部分在体内没有代谢就直接以原药的形式排入环境中，会长时间残留在土壤环境和水环境中，严重影响人类的健康[5-6]。因此，近几年来磺胺类抗生素的滥用造成的环境污染和风险隐患，成为了研究的热点。

目前磺胺类抗生素的残留检测方法有高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC） [7]、紫外可见分光光度法（Ultraviolet–Visible spectroscopy，UV-Vis） [8]、毛细管电泳法（ Capillary Electrophoresis，CE） [9-10]、电化学法[11-12]、酶联免疫吸附法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）[13]、荧光偏振免疫分析法[14]、高效液相色谱-串联质谱联用（High performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[15-17]等。现有的检测方法如ELISA方法特异性不高无法准确定性、检测复杂基质时可能出现假阳性;高效液相色谱法存在分离度不好，定性困难的缺点。超高效液相色谱-串联质谱法（Ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry ，UPLC-MS/MS）因分析效率高、灵敏度高等优势，成为抗生素残留分析的主流检测方法。已有的检测方法存在操作繁琐、耗时较长、检测抗生素种类或数量相对较少、不适于水样品快速筛查分析等缺点。

为了实现快速、准确的对水中残留的磺胺类抗生素进行了分析检测，本研究以Oasis HLB固相萃取柱富集和净化，UPLC-MS/MS测定水中16种磺胺类抗生素的残留，为水中抗生素的快速筛查提供参考。

磺胺类抗生素结构通式：

图1 磺胺类抗生素结构通式

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：UPLC（LC-20AD）超高压液相色谱仪（日本岛津公司）; API3200 質谱仪（美国AB公司）;T18高速均质仪（德国IKA公司）;纯水仪（上海洋沦精密设备科技有限公司）;小型旋涡混匀仪（德国IKA公司）;色谱柱为岛津Shim-pack XR-ODSⅡ（2.0 ×75 mm;2.2 μm）、Waters Acquity UPLC TSS T3色谱柱（100 ×2.1 mm，1.8 μm）。

试剂：乙腈（色谱级），德国默克公司;蒸馏水（娃哈哈纯净水）;固相萃取柱C18（Agela，3 mL/50 mg），HLB（Waters Oasis，3 mL/50 mg），标准品混合液（浓度100 mg/kg）由上海安谱实验科技股份有限公司。固相萃取小柱C18（500 mg/6 mL， Aglient）， Oasis HLB（500 mg/6 cc，Waters）、Bond Elut-SAX（500 mg/6 mL，Aglient）。

1.2 溶液配置

标准品混合液（100 mg/kg）：准确移取质量浓度为100 mg/kg的标准品0.5 mL于 5 mL 容量瓶中，用甲醇定容到5.00 mL，于-20 ℃冰箱避光保存。

标准曲线工作液：用流动相 0.1 %甲酸-乙腈溶液稀释混合中间液，配制系列标准曲线为 0.005、 0.01、 0.05、 0.10、 0.20、 0.50 mg/L。

1.3 分析方法

1.3.1 样品提取

取500 mL采集到的样品，固相萃取小柱先分别经过10 mL甲醇、10 mL水活化后，再将 500 mL水样上柱后以1 mL/min的流速真空抽干，再以10 mL甲醇洗脱，洗脱液用氮气吹至近干后加入1.0 mL 30 %甲醇溶液定容，过0.22 μm有机滤膜，超高压液相色谱—串联质谱测定。

1.3.2 检测条件

液相色谱条件：流动相由乙腈（A）和0.1 %的甲酸水溶液（V/V）（B）组成，梯度洗脱程序为：0～0.01 min，98 %A;0.01～5.0 min，98 %A～15 %A;5.0～8.5 min，15 %A;8.5～9.0 min，15 %A～98 %A;9.0～13.0 min，98 %A。柱温40 ℃，进样量5 μL，整个分析时间为13.0 min，各化合物保留时间见表1。

质谱条件：电喷雾离子源（Electrospray ionization，ESI），采用正离子多反应监测（Multiple reaction monitoring，MRM）扫描模式采集数据。以全扫描、子离子扫描等方式优化每种化合物母离子和子离子的强度。优化后的质谱分析条件：电喷雾电压（IS）5500.0 V，离子源温度（TEM）550℃，气帘气压力（ CUR ） 55 psi，雾化气压力（Gas 1）55 psi，加热气（Gas 2） 55 psi。16种磺胺类抗生素的母离子及子离子见表1。

2 结果与讨论

2.1 质谱与色谱条件的优化

根据16种磺胺类抗生素的性质，配制浓度为 1.0 mg/L的混合标准溶液，选择正离子模式扫描，对目标化合物在合适的扫描范围内进行一级质谱扫描，选定各个化合物的母离子，通过优化去簇电压、碰撞能、喷雾电压、离子源温度等因素，选取2个离子丰度高及稳定性好的特征碎片离子分别作为定量离子和定性离子。16种磺胺类抗生素种有2对同分异构体化合物，分别是母离子为281.0的磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对氧嘧啶和磺胺甲氧嗪，母离子为311.0的磺胺邻二甲氧嘧啶和磺胺间二甲氧嘧啶。通过对色谱流动相的优化，可以将其完全分开，总离子色谱图见图2。

比较了Acquity UPLC HSS T3 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）和岛津Shim-pack XR-ODSⅡ（2.0 mm×75 mm，2.2 μm）对16种抗生素的分离效果。结果显示，经Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱分离后16 种抗生素的峰形相对尖锐。这是由于HSS T3柱填充物是硅胶基质，采用的是低密度封端技术，它不仅能保留和分离水溶性的极性小分子有机化合物，而且还能提供了更宽的pH值操作范围，对于同时分析多种目标物的效果相对较佳，各化合物色谱图见图3。

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 净化柱的优化

比较了C18（500 mg/6 mL，Aglient）、Oasis HLB（500 mg/6cc，Waters）和Bond Elut-SAX（500 mg/6 mL，Aglient）3种固相萃取小柱对抗生素混合物的净化效果。结果表明Oasis HLB净化柱对目标化合物的净化回收效果明显好于其他2种净化柱（见图4）。可能由于Waters Oasis HLB吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮2种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，其保留机理为通过一个“特殊的极性捕获基团”来增加对极性物质的保留从而提供很好的水浸润性，即使净化柱柱床干涸，回收率也不受影响。

2.2.2 线性范围、检出限

根据每种抗生素的响应值，配制系列质量浓度的空白样品基质匹配标准溶液，在最佳条件下进行测定，以目标物定量离子的峰面积（Y）为纵坐标，对应质量浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，外标法定量。逐级稀释混合标准溶液，分别以信噪比（S/N）为3所对应的浓度作为本方法的检出限（LOD），方法的线性范围、LOD 结果见表2。结果显示，16种目标抗生素在各自线性范围内呈良好的线性关系，相关系数（R2）均大于0.99，LOD 为1.0～5.0 μg/kg。

2.2.3 回收率及精密度

在空白水样品中分别添加 5.0、20.0、100.0 μg/kg 3个水平的混合标准溶液，按照相同方法处理后进行UPLC- MS/MS测定，每个水平重复测定5次，计算回收率及相对标准偏差（RSD）。

3 结论

本试验建立了水中16种磺胺类抗生素残留的检测方法。样品直接采用HLB固相萃取提取，以0.1 %甲酸溶液和乙腈作为流动相，经UPLC-MS/MS测定。该方法灵敏度高、分离度好，操作简单，以固相萃取技术富集水样品，实现了水样处理的自动化，可用于水样环境中磺胺类抗生素的快速测定，为水环境中的污染物快速检測提供技术依据。

参考文献

[1]      孙晓杰，李兆新，董晓，等. 固相萃取-液相色谱-串联质谱法同时检测海水中抗生素多残留[J]. 分析科学学报，2016，32（5）：639-643.

[2]      Sun H，Zuo Y，Qi H，et al. Accelerated solvent extraction combined with capillary electrophoresis as an improved methodology for simultaneous determination of residual fluoroquinolones and sulfonamides in aquatic products[J]. Analytical Methods，2012，4（3）：670-675.

[3]     徐颖，王祺，苏墨，等. 磺胺抗生素在河流沉积物中的吸附特性研究[J]. 安全与环境学报，

2016（2）：278-283.

[4]     ZHANG Q Q，YING G G，PAN C G，et al. Comprehensive evaluation of antibiotics emission and fate in the river basins of China：Source analysis，multimedia modeling，and linkage to bacterial resistance[J]. Environmental Science & Technology，2015，49（ 11）： 6772-6782.

[5]     关舒函. 黑龙江省猪肉中五种磺胺类药物残留的检测与风险评估[D]. 哈尔滨：东北农业大学，2016.

[6]      于淼. 养殖业中磺胺类药物残留的危害及现状[J]. 现代畜牧科技，2015（2）：133.

[7]     周爱霞，苏小四，高松，等. 高效液相色谱测定地下水、土壤及粪便中4种磺胺类抗生素[J]. 分析化学，2014，42（3）：397-402.

[8]    Errayess S A，Lahcen A A，Idrissi L，et al. A sensitive method for the determination of sulfonamides in seawater samples by solid phase extraction and UV-Visible spectrophotometry[J]. Spectrochimica Acta Part A：Molecular and Biomolecular Spectroscopy， 2017，181： 276-285.

[9]     Mala Z，Gebauer P，Bocek P. New methodology for capillary electrophoresis with ESI-MS detection：Electrophoretic focusing on inverse electromigration dispersion gradient. High-sensitivity analysis of sulfonamides in waters[J].  Analytica  Chimica  Acta， 2016，

935： 249-257.

[10]    Ji H Y，Wu W，Duan Z J，et al. Sensitive determination of sulfonamides in environmental water by capillary electrophoresis coupled with both silvering detection window and in-capillary optical fiber light-emitting diode-induced fluorescence detector[J].  Electrophoresis，2017，38 （ 3 /4）： 452-459.

[11]   Lahcen A A，Arrayess S A，Amine A. Voltammetric determination of sulfonamides using paste electrodes based on various carbon nanomaterials[J]. Microchimica Acta，2016，183（7）：2169-2176.

[12]  Roman L D T，Alonso-Lomillo M A，Dominguez-Renedo O，et al. Tyrosinase based biosensor for the electrochemical determination of sulfamethoxazole[J]. Sensors and Actuators B： Chemical，2016，227：48-53.

[13]   赵银丽，张改平，邓瑞广，等. 恩诺沙星多克隆抗体制备及阻断ELISA检测方法的研究[J]. 河南工业大学学报（自然科学版），2008（05）：63-66.

[14]   王战辉，沈建忠，张素霞. 荧光偏振免疫分析检测磺胺二甲嘧啶—荧光标记物的合成与鉴定[J]. 中国兽医杂志，2007，043（006）：72-74.

[15]   Yuan S F，Liu Z H，Yin H，et al. Trace determination of sulfonamide antibiotics and their acetylated metabolites via SPE-LC-MS /MS in wastewater and insights from their occurrence in a municipal wastewater treatment plant[J]. Science of the Total Environment，2019，653： 815-821.

[16]   庞昕瑞，曾鸿鹄，梁延鹏，等. 固相萃取-超高效液相色谱—串联质谱法测定地表水中10种磺胺类抗生素残留[J]. 分析科学学报，2019

（4）：461-466.

[17]   狄鑫，崔贤程，孙康，等. 固相萃取/液相色谱串联质谱法测定饮用水中7种抗生素药物残留[J]. 现代化工，2019，398（12）：249-253.