一株猪丹毒丝菌的分离鉴定

程玉婷

（广东省农产品质量安全中心，广东 广州 510000）

猪丹毒病是一种在世界范围内均有发生且对养猪业有重要影响的疾病。猪丹毒病由猪丹毒丝菌引起。猪丹毒丝菌是一种革兰氏阳性菌、菌体平直或稍弯曲的纤细小杆菌、兼性厌氧、耐酸、无芽孢[1]。猪丹毒丝菌一般感染猪，但同时也可以感染绵羊、火鸡和人。猪丹毒丝菌感染人时，可以引起心内膜炎症、败血症[2]。猪丹毒丝菌作为一种条件致病菌，多达10%～50%的健康猪扁桃体中携带该菌，并且在健康猪及病猪的唾液、粪便中均可以分离到该病原体，该病最常见的感染途径是通过摄入受污染的食物或水及皮肤伤口感染，3月龄到3岁猪均易感。猪丹毒菌感染的临床症状有3种：急性、亚急性和慢性[3]。急性型又称败血型，发病猪只呈急性经过，体温突然升至42～43 ℃，食欲不振，粪便干结，后期下痢。病程急，死亡率高。亚急性型也称疹块型，猪只耳后、颈部、胸腹侧等部位会有红色形状的不规则斑块出现，界限明显、触之有热感，指压而褪色，俗称“打火印”。而慢性型一般表现为慢性关节炎、慢性心内膜炎和皮肤坏死等症状[4]。猪丹毒病一年四季均可以发病，但以潮湿、炎热多雨的季节多发[5]。

1 材料与方法

1.1 病料

病料来自广东省潮州市某大型猪场，采取新鲜病死猪的肝、脾等脏器进行病原菌分离鉴定。

1.2 细菌培养基和相关试剂

胰酶大豆琼脂（TSA）和胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）购自广东环凯微生物科技有限公司。

新生牛血清购自兰州民海生物工程有限公司，使用前56 ℃灭活30 min，保存于-20 ℃。

革兰氏染色液采购自广东环凯微生物科技有限公司。

引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 引物合成设计

实验中所用到的引物（见表1）。

表1 实验中所用到的引物

1.4 猪丹毒丝菌的分离与鉴定

1）以烧红的无菌剪刀烫烙病例脏器表面，用接种环自烫烙的部位插入组织中，在无菌的加入5%新生牛血清的TSA平板上涂拭，在超净工作台内对平板进行划线，目的是可以得到单菌落；

2）将划线稀释的平板置于生化培养箱培养18～24 h；

3）在平板上挑选单菌落，转到新鲜的TSA平板（添加5%新生牛血清）上继续划线培养18～24 h进行纯化；

4）革兰氏染色鉴定；

5）16S rRNR PCR鉴定

PCR反应、条件体系如下：

TaKaRa Ex Taq（5 units/μL）0.25 μL

10×Ex Taq Buffer（Mg2+free）2 μL

dNTP Mixture（2.5 mM each）2 μL

25 mM MgCl21.5 μL

16SrRNA-F、16SrRNA-R各1.5 μL

dd H2O up to 25 μL

反应总体系为25μL，模板为挑选的3-5个单菌落。PCR反应条件为

1.5 药物敏感性的测定

药敏实验采用Kirby-Baner（K-B）纸片扩散法，检测分离得到的菌株对抗菌药物的敏感性。

1）将复苏好的菌株进行划线培养，放入恒温培养箱培养18～24 h；

2）取无菌棉签蘸取平板上3～5个菌落，于3 mL生理盐水中进行稀释，调节菌液浓度至0.5麦氏比浊浓度；

3）另取一无菌棉签伸入细菌瓶中，待无菌棉签浸润后，在细菌瓶管壁上挤压掉多余的水分，用棉签涂布TSA平板。为使平板上菌落分布均匀，应涂布完平板后将平板转动60°，再次进行涂布，依次重复6次；

4）用镊子夹取药敏纸片，使药敏纸片平贴于涂满菌液的培养基表面，所有药敏纸片应当在15 min内贴到培养基上；

5）将平板翻转，置于37 ℃恒温培养箱培养20～24 h后，将平板从恒温培养箱中拿出，依据美国临床实验室标准化协会（CLSI）判定标准进行耐药性的判定。

2 结果

2.1 革兰氏染色结果

从病变组织中分离培养细菌后，制成细菌涂片，经革兰氏染色后镜检，可观察到该菌为纤细的小杆菌，成对或呈长丝状。镜检结果见图1。

图1 革兰氏染色镜检图

2.2 16SrRNR PCR鉴定结果

从经纯化的培养物中挑取3～5个菌落，通过PCR扩增后，经电泳检验，出现特异性条带，目的条带大小为472 bp，结果见图2。

图2 PCR鉴定结果

2.3 药物敏感性的测定

药物敏感性的测定结果（见表2）。药敏测定结果显示，该猪丹毒丝菌对阿莫西林、青霉素、氟苯尼考敏感，对多西环素中度敏感，对恩诺沙星、替米考星、四环素不敏感。

表2 药敏测定结果

3 结论与讨论

1）以上结果符合猪丹毒丝菌的相应特性，确诊为感染猪丹毒丝菌。

2）本株猪丹毒丝菌能引起猪的全身性败血性死亡，说明毒力较强。经了解，该猪场发病猪群发病时间为5月份，这段时间天气出现连续性降雨，猪舍粪便清理不够彻底，环境相对较差，这可能诱发了本次猪群的病因。

3）针对该次猪丹毒丝菌发病，可以选择性采用阿莫西林、青霉素、氟苯尼考结合实际予以治疗。

4）猪丹毒丝菌病不常发，但一旦发病，病程急，病程短，猪场养殖者往往措手不及，养殖者应加强防范。