高粱转录因子SbWRKY71基因的克隆及其在逆境胁迫下的表达分析

杜巧丽 蒋君梅 陈美晴 方远鹏 李向阳 任明见,2 谢 鑫,*

(1 贵州大学农学院农业微生物特色重点实验室，贵州 贵阳 550025；2 国家小麦改良中心贵州分中心，贵州 贵阳 550025；3 贵州大学绿色农药与农业生物工程教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025)

高粱(Sorghumbicolor)属于禾本科单子叶植物，是一种典型的旱粮经济作物，具较强的耐盐碱性、抗旱性、耐高温等抗逆特性[1]。但近年来，高粱受到病毒[2]、重金属[3]和真菌[4]等逆境胁迫，以及多种非生物逆境胁迫的影响，如低温[5]、干旱、高盐[6]等，严重影响高粱的产量和品质。因此，对高粱抗逆境胁迫基因进行研究具有重要意义。

转录因子(transcription factor，TF)又称反式作用因子，在植物次生代谢过程具有重要作用。它也可特异性与基因的启动子结合，在基因的表达过程中起调控作用，同时还能结合生物体内外的信号因子，进而对外界环境刺激做出应答反应[7-8]。植物转录因子主要分为2种，一种为特异性转录因子，它们主要通过选择性调控某些基因的转录表达，另一种是非特异性转录因子，通过非选择性调控基因的转录表达[9]。转录因子广泛参与植物生长发育的各个环节(如开花[10]、衰老[11]、生长繁殖[12]、非生物胁迫[13]和生物胁迫[14])。WRKY作为植物中一类重要转录因子，在植物的整个生长周期中发挥重要作用。研究报道，WRKY转录因子含有高度保守的核心氨基酸序列，在C-末端含有一个锌指结构，可对(T)(T)TGAC(C/T)序列进行特异性识别，同时参与植物的抗病反应[15-16]；WRKY71作为WRKY转录因子家族的一员，目前已在拟南芥(Arabidopsisthaliana)[17]、水稻(Oryzasativa)[18]、草莓(Fragariavesca)[19]、芥菜(Brassicajuncea)[20]、玉米(Zeamays)[21]等植物中报道，但鲜见WRKY71基因在高粱中的研究报道。

本试验从高粱中克隆得到一个SbWRKY71基因，利用生物信息学方法研究其基本特征，并通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，RT-qPCR)检测SbWRKY71基因在不同组织、不同激素以及逆境胁迫条件下的相对表达量，了解其在抗逆胁迫中的作用，旨在为SbWRKY71基因的生物学功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 高粱品种及处理方法 本研究所用高粱BTx623品种由贵州大学植物病理教研室保存。高粱种子处理方法及培养条件参照蒋君梅等[22]的方法，使用激素脱落酸(abscisic acid，ABA，200 μmol·L-1)、水杨酸(salicylic acid，SA，1 mmol·L-1)、吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA，10 μmol·L-1)、氯化钠(NaCl，250 mmol·L-1)、γ-氨基丁酸(4-aminobutyric acid，GABA，1 mmol·L-1)、 甘露醇(D-Mannitol，300 mmol·L-1)、鞭毛蛋白(flg22，100 nmol·L-1)、翻译延长因子(translation elongation factor，elf18，100 nmol·L-1)和几丁质(Chitin，8 nmol·L-1)进行喷施处理，分别在0、0.5、1、3、6、9、12和24 h进行取样，设置3个生物学重复，每个重复处理3株苗，将所取样品立即用液氮进行速冻，置于-80℃冰箱保存备用。

1.1.2 试剂 本研究采用北京康润诚业生物科技有限公司的RT-qPCR反转录试剂盒；ABA、SA、IAA、NaCl、GABA、D-Mannitol试剂均购自北京酷来搏科技有限公司；flg22、elf18和Chitin分别购自南京金斯瑞生物科技有限公司、美国Ezbiolab和圣克鲁斯生物技术(上海)有限公司。

1.2 高粱SbWRKY71基因克隆

取处理好的高粱样品，提取RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板，使用引物SbWRKY71-F/SbWRKY71-R对SbWRKY71基因进行扩增，PCR产物经纯化后插入pEASY-Blunt载体(北京全式金生物技术有限公司)。引物设计和PCR扩增反应体系参照陈美晴等[23]的方法。

1.3 生物信息学分析

获取其他物种SbWRKY71同源蛋白序列，利用MEGA7.0软件，以邻接法(neighbor-joining，NJ；bootstrap=1 000)构建系统发育树，后经DNAMAN6.0完成序列比对；根据EXPASy[24](https://web.expasy.org/)完成SbWRKY71蛋白理化性质预测；SbWRKY71蛋白的高级结构测定、亚细胞定位等生物信息学分析参照已报道的方法[25]。

1.4 高粱SbWRKY71基因表达分析

以高粱SbEIF4a为内参基因，分别以高粱不同组织以及经不同条件处理后的叶片总cDNA为模板，检测SbWRKY71基因表达量。扩增引物如表1所示，扩增体系参照已报道的方法[24]。

表1 引物序列

2 结果与分析

2.1 高粱SbWRKY71基因的PCR扩增

以高粱BTx623苗期cDNA为模板进行PCR扩增，得到序列大小为1 335 bp的目的基因片段，共编码364个氨基酸。随后采用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测(图1)，并进行测序比对，得到的条带大小与数据库中的一致。

Note：1：SbWRKY71. M：Marker.

2.2 高粱SbWRKY71蛋白理化性质分析及序列分析

采用Prot-param工具对SbWRKY71蛋白理化性质进行分析(表2)；同时利用Softberry软件对SbWRKY71蛋白进行亚细胞定位，预测该蛋白定位于细胞核。

表2 SbWRKY71基因编码蛋白的基本特征

利用DNAMAN6.0将高粱SbWRKY71与其他物种的WRKY71氨基酸序列进行多序列比对及同源性分析，如图2所示，不同物种间WRKY71相关蛋白的氨基酸序列均存在1个保守的WRKY结构域，整体一致性为63%，即WRKY71在不同植物间相对保守。同时利用MEGA7.0对水稻、短柄草、玉米、高粱、小麦和二穗短柄草等物种的WRKY71蛋白序列进行系统发育进化树的构建，结果表明，高粱SbWRKY71与禾本科作物玉米ZmWRKY71的亲缘关系最近，且为75%(图3)。

注：黑色框表示WRKY71蛋白保守结构域；Sb：高粱(Sorghum bicolor)；Zm：玉米(Zea mays)；Os：水稻(Oryza sativa)；Ta：小麦(Triticum aestivum)；Bd：二穗短柄草(Brachypo diumdistachyon)。

注：Sb：高粱(Sorghum bicolor)；Zm：玉米(Zea mays)；Si：谷子(Setaria italica)；Os：水稻(Oryza sativa)；Ta：小麦(Triticum aestivum)；Bd：二穗短柄草(Brachypo diumdistachyon)；Eg：油棕(Elaeis guineensis)；Gh：棉花(Gossypium hirsutum)；Br：油菜(Brassica rapa)；At：拟南芥(Arabidopsis thaliana)；Va：葡萄(Vitis amurensis)；Cp：腊梅(Chimonanthus praecox)；Pc：樱桃(Prunus cerasus)。

2.3 高粱 SbWRKY71蛋白结构预测

利用NPS@在线预测SbWRKY71蛋白二级结构，SbWRKY71蛋白由364个氨基酸组成，其中α-螺旋占32.69%，无规则卷曲占61.54%，无β-折叠。利用SMART在线软件预测该蛋白保守功能域，SbWRKY71蛋白主要含有2个低复杂区和1个WRKY结构域。通过SWISS-MODEL预测该蛋白的三级结构，发现SbWRKY71蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲构成(图4)，与NPS@预测的结果一致。

图4 SbWRKY71蛋白三级结构预测

2.4 高粱SbWRKY71基因顺势作用元件分析

利用PlantCARE对SbWRKY71基因的顺势作用元件进行分析(表3)，结果表明SbWRKY71基因可能参与脱落酸、茉莉酸等信号通路。

表3 SbWRKY71基因启动子区顺势作用元件预测

2.5 SbWRKY71基因表达分析

2.5.1SbWRKY71基因组织表达特征 为探究SbWRKY71基因的组织表达模式，采用qRT-PCR分析SbWRKY71在高粱根、茎、叶和芽中的表达情况。结果表明，SbWRKY71基因在根、茎、叶和芽不同组织均有表达，并具有组织特异性，其中在叶中的表达最高，其次是根，在茎和芽中表达较少(图5)。

注：不同小写字母表示相对表达量具有显著差异(P<0.05)；内参基因：SbEIF4a。下同。

2.5.2SbWRKY71基因响应激素表达分析 为检测植物激素是否影响SbWRKY71的表达，分别用SA、ABA和IAA处理高粱，发现在SA处理下，SbWRKY71的表达呈先升后降趋势(图6-A)，ABA和IAA处理后，SbWRKY71的表达呈现先下降后升高再下降的趋势(图6-A、B、C)，基因表达量均在6 h出现最大值。

2.5.3SbWRKY71基因响应干旱及盐胁迫表达分析 用GABA、D-Mannitol、NaCl模拟干旱及盐胁迫，对SbWRKY71基因表达进行分析。结果表明，在GABA(图6-D)、D-Mannitol(图6-E)和NaCl(图6-F)处理下，SbWRKY71基因均受到诱导表达，其表达量分别在3、6和9 h达到最大值。以上结果说明SbWRKY71可能是高粱响应干旱及盐胁迫的一个功能基因。

2.5.4SbWRKY71基因响应病原相关分子模式(PAMPs)表达分析 为检测SbWRKY71在PAMPs激发子flg22、elf18和Chitin处理下的表达量变化，分别用flg22、elf18和Chitin模拟高粱生物胁迫下的影响，发现经flg22、elf18处理后，SbWRKY71基因表达量在极短时间内均被显著抑制，之后表达量几乎维持在相同水平(图6-G、I)，但在Chitin处理下，SbWRKY71基因表达量呈现出先升后降的表达模式(图6-H)。上述结果表明，SbWRKY71基因表达受到flg22和elf18的显著抑制，而受到Chitin的诱导表达，综上所述，SbWRKY71在参与植物先天免疫应答过程中具有重要作用。

图6 SbWRKY71基因表达分析

3 讨论

植物在生长过程中可能会遭受各种非生物和生物胁迫，此时植物自身会产生一系列复杂的防御机制(包括生理和代谢过程中的防御反应)，来保护自身免受各种逆境胁迫的危害。这些防御反应过程涉及复杂的信号网络，并通过大量的转录因子和防御反应基因对防御过程进行调节。植物中WRKY转录因子是植物中最大的一类转录因子，广泛参与植物的生长发育、防御反应和代谢调控[26]。大量研究表明，WRKY转录因子在受到病原菌[如丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)、黄单胞菌(Xanthomonasaxonopodis)]侵染后，可能被作为正调控因子，也可能被作为负调控因子[27-28]。在小麦[29]、拟南芥[30-31]和水稻[18]中，WRKY71基因分别在调控植物应对病害抗性、叶发育、花期调控以及非生物胁迫等中具有重要意义。

本研究结果表明，经过激素SA处理后的高粱SbWRKY71基因表达量在较短时间内显著上调，处理6 h时表达量升高并达到最大值，在12 h又显著降低，这与在玉米中[21]的研究存在一定相似性，即ZmWRKY71的表达基本呈现先上调后下调的情况，说明在不同物种中WRKY71基因在激素应答过程中存在一定差异；在ABA处理下，SbWRKY71的基因表达量在1 h被显著抑制，但在6 h又被显著诱导并达到最大值，而在拟南芥中[17,31]，AtWRKY71在ABA处理下，基因受到诱导表达，从侧面暗示WRKY71基因在参与调控植物应对激素应答反应中具有重要作用。此外，该类基因在组织表达上也存在显著差异，SbWRKY71基因主要表现在叶中表达，在茎中低表达，但在草莓中[19]，FvWRKY71基因主要在果实中表达，并且该基因的表达量随着果实的成熟表达量显著升高，而OsWRKY71在孕穗期剑叶中表达量最高[18]，由此可知WRKY71基因的特异表达在不同物种中也存在一定的差异性；在NaCl处理下，SbWRKY71基因表达呈先升后降趋势，即在9 h达到最大值，大约持续3 h后，又显著下调；这与芥菜型油菜[20](Brassicajuncea)部分基因在高盐处理下的研究结果一致，即BjuWRKY71-1、BjuWRKY71-2和BjuWRKY71-4基因的表达量呈先升后降模式，但BjuWRKY71-3基因在高盐条件下，其表达量在24 h内一直逐渐升高，同时与拟南芥AtWRKY40同源的基因BnD11在抗旱性品种中报道极为相似[32]；在小麦中[33]，TaWRKY33也能受到NaCl的诱导表达，进而提高了转基因拟南芥和小麦对盐的耐受性，由此说明不同WRKY转录因子在感知盐胁迫下的基因表达存在相同的现象。在模拟干旱胁迫下，SbWRKY71基因在6 h时受到显著诱导，其他时间点维持在相同水平，在拟南芥中，WRKY71的过表达能诱导拟南芥种子萌发，并对干旱胁迫显得更加敏感，说明WRKY71基因可能是响应干旱胁迫的一个功能基因。在flg22、elf18模拟生物胁迫下，SbWRKY71基因的表达量在较短时间内被显著抑制，这与桑树(Morusalba)中MaWRKY29的研究结果一致[34]，说明WRKY转录因子在参与植物先天免疫应答过程中具有重要作用。

有研究指出，水稻WRKY71转录因子OsWRKY71基因在耐冷过程中主要起正调控作用[35]；同时在拟南芥中，过表达AtWRKY71基因有助于增强植物对丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)的敏感性[36]；推测SbWRKY71基因在病原侵染及冷胁迫应答过程中也可能有类似的功能，因此本研究有望为今后进一步研究SbWRKY71基因的功能奠定基础。

4 结论

本研究结果表明，从高粱中克隆的SbWRKY71基因是一个带有典型WRKY结构域的WRKY家族成员，根据多序列比对，高粱SbWRKY71与玉米亲缘关系最近，编码364个氨基酸，蛋白质分子质量为38.95 kDa，其理论等电点为8.5(碱性蛋白)。RT-qPCR结果表明，SbWRKY71基因表达具有组织特异性，且受植物激素、干旱、盐胁迫以及PAMPs的影响。本研究为进一步揭示WRKY71基因的生物学功能，以及在调节高粱抗性和响应植物激素等过程中的作用提供了基础。