ε-聚赖氨酸盐酸盐对气调包装即食小龙虾的保鲜效果研究

刘文浩，徐晓云，吴婷，徐若滢，刘浩越

(华中农业大学 食品科学技术学院，武汉 430070)

小龙虾，学名克氏原螯虾(Procambarusclarkii)，也称红螯虾和淡水小龙虾，是我国重要的淡水经济虾[1]。小龙虾肉质有弹性，味道鲜美，风味独特，具备蛋白质含量高、脂肪和胆固醇含量低等特点，富含镁、锌、碘、硒和虾青素等对人体健康有益的营养物质，受到消费者的广泛喜爱[2-3]。但是小龙虾的水分、蛋白质含量高，加之运输和储藏过程中的温度波动和环境影响，易滋生微生物腐败变质，导致货架期较短[4-6]。邓灵等[7]研究发现熟制小龙虾中主要有蜡样芽孢杆菌与苏云金芽孢杆菌；周涛等[8]在不同温度存放即食小龙虾，探究了其微生物菌群变化，在4 ℃贮藏条件下优势菌群为海洋杆菌属和希瓦氏菌属，在25 ℃贮藏条件下的优势菌群为哈撒韦氏菌属、芽孢杆菌属、狭义梭菌属，两种贮藏温度下优势腐败菌不同；于晓慧等[9]从储藏末期即食小龙虾中分离出的优势腐败菌为柠檬酸杆菌。

常见的虾类产品防腐保鲜方法有低温储藏、加热杀菌、辐照杀菌、真空包装、气调包装、食品防腐剂的添加等，其中添加食品防腐剂能够在保证食品营养价值和风味的同时起到抑菌、抗氧化的作用，可有效防止腐败变质，延长产品货架期。目前天然抑菌剂和化学防腐剂相比具有安全性高和抑菌谱广等优点，按照来源可分为动物源、植物源和微生物源三类，有不同的应用范围和特点，就即食食品延长货架期来说，具备较高的研究价值[10-11]。ε-聚赖氨酸盐酸盐是链霉菌属发酵过程中的代谢产物，经分离提取精制而获得，是一种生物防腐剂具有抑菌能力强，抑菌范围广、水溶性好、热稳定性强等特点[12]，根据GB 2760-2014添加限量为0.30 g/kg。李秋莹等[13]综述了ε-聚赖氨酸在水产品中不同的应用方式和抑菌机理，能有效保持水产品的新鲜程度，延长货架期；杨华等[14]制备了ε-聚赖氨酸盐酸盐微胶囊并将其应用在美国红鱼鱼片中，具有较好的保鲜性能和长效抑菌性。

因此，本研究对即食小龙虾中的腐败菌进行分离鉴定，通过单因素抑菌试验确定ε-聚赖氨酸盐酸盐的最佳抑菌浓度，并应用在产品中，通过对15 ℃存放过程中菌落总数、大肠菌群、Aw、TVB-N、TBARS的研究，分析了天然保鲜剂对小龙虾的保鲜效果及货架期的影响，为进一步研究小龙虾及其制品的防腐保鲜提供了一定科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

即食小龙虾(原料小龙虾经油炸、卤制、摊晾、气调包装等环节制作)：某酱卤食品有限公司提供；平板计数琼脂、结晶紫中性红胆盐琼脂、煌绿乳糖胆盐琼脂、营养琼脂、营养肉汤：北京陆桥技术股份有限公司；DNA提取试剂盒：武汉擎科生物有限公司；ε-聚赖氨酸盐酸盐：浙江新银象生物工程有限公司；D-异抗坏血酸钠：诸城华源生物工程有限公司；甲基红、溴甲酚绿、2-硫代巴比妥酸：国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器

DHP-9082电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；HWS-260恒温恒湿箱 宁波乐电仪器制造有限公司；SW-CJ-2D双人超净工作台 浙江苏净净化设备有限公司；DK-98-Ⅱ电 热恒温水浴锅 天津泰斯特仪器有限公司；SHA-A恒温振荡器 常州天瑞仪器有限公司；GI54DP高压灭菌器 厦门致微仪器有限公司；UV759紫外可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；TDZ5-WS离心机 湖南平凡科技有限公司；AR224CN电子天平 奥豪斯仪器有限公司；HD-3A水分活度测量仪 无锡华科仪器仪表有限公司；KDN-103A自动定氮仪 上海纤检仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 气调包装即食小龙虾中腐败菌的分离纯化

按GB/T 4789.2-2010中的方法略有改动，将样品稀释液取0.1 mL涂布于已灭菌的NA营养琼脂，同时做空白对照，每组样品做3组平行。于37 ℃恒温培养，培养48 h 后，选取菌落数在30～300的稀释度进行计数。

根据菌落形态、革兰氏染色结果进行分类，在营养琼脂平板上划线分离(重复3次划线纯化)，于37 ℃恒温培养24 h，挑取典型单一菌落于-20 ℃磁珠保存。

1.2.2 腐败菌的16S rDNA鉴定

1.2.2.1 提取细菌基因组DNA

将低温保藏的菌种用LB培养基于37 ℃振荡培养18 h活化，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，具体步骤根据试剂盒使用说明书。

1.2.2.2 PCR扩增

用16S通用引物，2 μL的27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)，2 μL的1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)对DNA进行PCR扩增。PCR参数设置为98 ℃预变性2 min，98 ℃变性10 s，57 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，72 ℃终延伸5 min，用2%琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物。

1.2.2.3 由武汉擎科生物有限公司测序

对获得的序列在NCBI网站进行BLAST序列分析，选取相似度高的基因序列，采用MEGA 7.0软件分析构建系统发育树。

1.2.3 保鲜剂对腐败菌的抑制作用

对分离纯化的两种菌进行活化和复壮。从磁珠保藏管中分别取出一颗磁珠放入含有100 mL营养肉汤培养基的锥形瓶中，于恒温水浴摇床37 ℃，150 r/min培养18 h，菌液浓度约为108CFU/mL。

对ε-聚赖氨酸盐酸盐按照0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 g/kg浓度梯度用无菌水配制成100 mL的抑菌液备用。

根据顾胜[15]的方法有所改动，活化菌液浓度约为108CFU/mL，在无菌操作下稀释6～7倍(至可计数)，分别吸取同等体积的菌液和抑菌液到试管中混匀，同时将相同体积的菌液与营养肉汤混匀做空白对照，各取0.1 mL至培养平皿中，倒入已灭菌冷却至45～50 ℃的营养琼脂培养基，充分混匀，凝固后倒置于37 ℃培养箱中培养24 h，观察计数。统计平板上的菌落数，计算抑菌率，抑菌率=(空白组菌落数-抑菌组菌落数)÷空白组菌落数×100%。

1.2.4 保鲜剂的验证实验

ε-聚赖氨酸盐酸盐按照配比加入到小龙虾的卤制中，以不加保鲜剂的小龙虾为对照。在15 ℃储藏中测定产品的感官、菌落总数、大肠菌群、TBARS值、TVB-N值、Aw值验证保鲜剂对小龙虾的保鲜效果。

1.2.5 指标测定1.2.5.1 感官评定

采取满分10分的评分制度[16-17]，由6名感官评定人员参与评鉴，对气调包装即食小龙虾从肉质、外观、气味3个方面进行分析，当评分在6分以下则表示感官品质较差、不可接受，具体评分标准见表1。

表1 感官评分标准Table 1 The sensory evaluation criteria

1.2.5.2 菌落总数的测定

按照GB 4789.2-2016中食品微生物菌落总数的测定方法实行。

1.2.5.3 大肠菌群的测定

按照GB 4789.3-2016中食品微生物大肠菌群的平板计数法实行。

1.2.5.4 水分活度(Aw)的测定

按照GB 5009.238-2016中食品水分活度的水分活度仪扩散法实行。

1.2.5.5 挥发性盐基氮(TVB-N)的测定

按照GB 5009.228-2016中食品中挥发性盐基氮的自动凯氏定氮仪法实行。

1.2.5.6 脂质过氧化(TBARS)的测定

称取10 g 绞碎均匀的虾肉，加入50 mL 7.5%三氯乙酸和0.1% EDTA，振荡30 min后过滤，取上清液5 mL加入5 mL TBA 溶液，沸水浴加热40 min，冷却后 4000 r/min离心20 min，取上清液加入5 mL氯仿，摇匀静置分层，取上清液在532 nm处比色[18-19]。TBARS值计算公式如下：

TBARS/(mg/kg)=A532÷W×9.48。

式中: A532为待测液在532 nm处的吸光度值；W为样品质量，g。

1.2.6 数据处理与分析

实验采取3组平行，用SPSS 21和Excel软件处理数据，用Origin作图，采用NCBI网站和MEGA 7软件分析16S rDNA测序结果。

2 结果与分析

2.1 平板菌落计数和腐败菌的分离

即食小龙虾肉经均质、浓度梯度稀释后，测定菌落总数和大肠菌群，结果见图1。15 ℃的气调包装即食小龙虾在第2天大肠菌群超过2 lg CFU/g，根据GB 10136-2015，已超标，不能食用。

图1 即食小龙虾菌落数Fig.1 The bacterial colony count of ready-to-eat crayfish

根据菌落形态、革兰氏染色结果对平板上的菌落进行分类，并计算所占比例，结果见表2。对腐败菌划线分离，保藏备用。

表2 腐败菌的形态特征及比例Table 2 The morphological characteristics and proportion of spoilage bacteria

2.2 16S rDNA鉴定

对筛选得到的两株菌进行DNA提取，利用通用引物进行PCR序列扩增，产物凝胶电泳图见图2，条带单一明亮，大小约为1200 bp。

图2 菌株扩增凝胶电泳图Fig.2 Gel electrophoresis of strain amplification

对PCR产物测序，得到基因序列在NCBI网站进行BLAST序列分析，选取相似度在98%以上的菌株用MEGA 7软件构建系统发育树，结果见图3。

图3 菌株系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strains

由图3可知，两株菌归类为弗氏柠檬酸杆菌，将其命名为弗氏柠檬酸杆菌J1和弗氏柠檬酸杆菌J2。

2.3 ε-聚赖氨酸盐酸盐对腐败菌的抑菌效果

ε-聚赖氨酸盐酸盐作为一种广谱抑菌剂，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌均有抑制作用，它是通过破坏细胞膜和细胞壁膜的完整性，造成物质外渗，影响蛋白质合成等正常生理功能，抑制微生物生长[20-21]。实验结果表明，ε-聚赖氨酸盐酸盐对弗氏柠檬酸杆菌J1和J2均具有较强的抑制作用，在低浓度添加量0.1 g/kg时就可达到抑菌率100%，未超出GB 2760-2014的添加限量0.30 g/kg，可作为单一防腐剂使用。

2.4 天然保鲜剂的保鲜效果应用结果

即食小龙虾在存放过程中由于温度波动，脂肪和蛋白质氧化等容易滋生微生物，引起产品腐败，根据前期实验室研究基础添加1.5% D-异抗坏血酸钠能够有效降低酱卤产品的氧化程度，因此添加0.01% ε-聚赖氨酸盐酸盐和1.5% D-异抗坏血酸钠可达到抑制微生物生长和抗氧化的目的，延长气调包装即食小龙虾在(15±2) ℃储藏条件下的货架期。

2.4.1 感官评价

由表3可知，随着存放时间延长，对照组和保鲜剂处理组的感官评分逐渐降低，但处理组下降的程度明显小于对照组。对照组在1～3 d，实验组在1～5 d时小龙虾的组织结构完整，肉质紧实有弹性，体表颜色鲜红，气味正常，无明显变化，处于一级和二级鲜度，感官可接受。对照组到第4天，处理组到第6天，感官评分<6，此时小龙虾结构变得松散，虾肉发硬发黑，外壳变暗红，出现黑色斑点，略带异常气味，感官不可接受，认定小龙虾已经腐败变质。说明ε-聚赖氨酸盐酸盐和D-异抗坏血酸钠维持了小龙虾的感官品质，抑制了存放过程中微生物的滋生，起到了较好的防腐保鲜效果，延长了产品的货架期。

表3 感官评分Table 3 The sensory evaluation scores

2.4.2 菌落总数和大肠菌群

由图4和图5可知，在储藏过程中即食小龙虾的大肠菌群和菌落总数逐渐增加，对照组明显高于保鲜剂处理组。根据GB 10136-2015和李肖婵的研究[22]，大肠菌群数2 lg CFU/g和菌落总数5 lg CFU/g为货架期终点。对照组在第2天时大肠菌群数已超过2 lg CFU/g，产品不能食用；处理组在1～4 d时大肠菌群和菌落总数都<10，第5天开始微生物生长，第6天时大肠菌群数到3.6 lg CFU/g，菌落总数达到5.1 lg CFU/g，小龙虾已经腐败。与对照组相比，保鲜剂明显延缓了微生物的生长，保证了即食小龙虾的存放，货架期延长了4 d。

图4 大肠菌群变化Fig.4 Changes of coliform

图5 菌落总数变化Fig.5 Changes of the total number of bacterial colony

2.4.3 TVB-N变化

由图6可知，小龙虾在存放中挥发性盐基氮的含量逐渐升高，且对照组的含量显著高于保鲜处理组。根据GB 2733-2015和于晓慧的研究，将TVB-N值20 mg/100 g作为腐败临界值，对照组在1～3 d内挥发性盐基氮的含量持续上升，达到21.6 mg/100 g。处理组在1～4 d内缓慢增长，由于微生物的生长分解蛋白质产生盐基氮类物质，在第6天达到22.3 mg/100 g，产品不可食用。因此，保鲜剂的处理能够抑制即食小龙虾中微生物的生长，减缓挥发性盐基氮值的升高，有效延长了产品的货架期。

图6 TVB-N值变化Fig.6 Changes of TVB-N values

2.4.4 TBARS值的变化

由图7可知，TBARS值与即食小龙虾的储藏时间呈正相关，这是由于在存放过程中小龙虾中的不饱和脂肪酸不断被氧化产生醛和酮等过氧化物[23]，使TBARS值升高。对照组明显高于保鲜剂处理组，是由于ε-聚赖氨酸盐酸盐抑制微生物的生长分解脂肪，D-异抗环血酸钠抑制脂质的过氧化，减缓了TBARS值的增长，起到了保鲜的作用。

图7 TBARS值变化Fig.7 Changes of TBARS values

3 结论

通过对15 ℃下储存的气调包装即食小龙虾中腐败菌进行分离筛选，16S rDNA序列鉴定得到优势腐败菌为弗氏柠檬酸杆菌；研究了ε-聚赖氨酸盐酸盐对腐败菌的抑制作用，使用量在0.1～0.3 g/kg范围内均能达到100%抑菌率；添加了0.01% ε-聚赖氨酸盐酸盐和1.5% D-异抗坏血酸钠的气调包装即食小龙虾在(15±2) ℃条件下，能够有效保持小龙虾的感官品质，明显减少了微生物数量的增长，减缓了TVB-N含量、TBARS值的上升速率，保持了产品的新鲜程度，使即食小龙虾的货架期由原来的2 d延长到6 d。