鲫鱼与草鱼的肠道微生物区系及主要消化酶活性研究

谭 恺，徐 灿

（上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）

鲫鱼（Carassius auratus）在我国拥有悠久的养殖历史，是我国最常见的杂食性淡水鱼类之一，同时也是优质的养殖鱼类和经济鱼类，具有适应力强、繁殖能力高、抗病害能力好、生长快等特点[1]。草鱼（Ctenopharyngodon idella）作为“四大家鱼”之中草食性鱼类的典型代表，是全球淡水养殖产量最大的一个品种，在全国范围内分布广泛，具有饲养简单、生长周期短、产量高等显著特点，但抗病害能力相对较差[2]。

胃肠道作为整个机体同外界最广泛接触的器官之一。它不仅承担着消化吸收机体摄入的营养物质的功能，同时也是机体为了阻止肠道细菌移位而设立的一道重要防线。同大多数生物一样，鱼类的肠道内也栖居着大量的微生物。在漫长的进化过程中，这些微生物与宿主之间建立起了长期且稳定的共生关系，进而直接影响着宿主的饮食习惯、身体机能等。除此之外，肠道内的酶活性也在很大程度上影响着鱼的各项生理功能，其活性更是直接决定了机体对于营养物质的消化吸收程度[3]。草鱼和鲫鱼是市面上两种主要的鱼类，在水产养殖业中占有重要的经济地位。研究鱼肠道中微生物及酶活，能够在养殖过程中为鱼类健康状况提供具体评价指标，同时对鱼病的防治及饲料的开发提供重要的指导意义。

笔者选取同一人工养殖水域，生活环境完全一致的草鱼和鲫鱼进行试验，探究鲫鱼与草鱼在肠道微生物区系和肠道主要消化酶活性的差异，进一步分析其对于鱼类本身的饮食习惯和健康状况的影响，以期为鲫鱼和草鱼的养殖与生活习性机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 样品采集于2019 年7 月21 日，在湖南省涟源市桥头河镇某村，选取无生活污水污染、未投放人工饲料，且多种鱼类混养的池塘。采集喂养时间和生活环境一致的草鱼和鲫鱼各5 尾，将活鱼带回湖南省长沙市湖南中医药大学微生物学实验室进行处理。草鱼重（1 450±10）g/尾，鲫鱼重（440±10）g/尾。

1.1.2 培养基肠道细菌总数的测定使用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；真菌（霉菌与酵母菌）数的分析使用马丁孟加拉红链霉素琼脂培养基；乳酸菌数量的测定使用MRS 琼脂培养基；双歧杆菌数量的分析用BBL琼脂培养基。具体配方参考赵斌等[4]的微生物学实验进行。

1.1.3 试 剂荧光素二乙酸酯（Fluorescein diacetate，又称3', 6'-二乙酰-荧光素，FDA）储存液：2 mg FDA 和1 mL 丙酮，棕色瓶装，-20 ℃避光保存；磷酸盐缓冲液（pH 值7.6）：4.0 g NaCl、0.1 g KCl、0.27 g Na2HPO4、0.12 g KH2PO4溶于蒸馏水后定容至500 mL；DNS 液：称取酒石酸钾钠91 g 溶于500 mL 蒸馏水中，在溶液中依次加入3.15 g 3,5-二硝基水杨酸和20 g NaOH，加热搅拌使其溶解，再加入2.5 g 苯酚，2.5 g 无水Na2SO3，搅拌使之溶解，冷却后定容至1 L，贮于棕色瓶中，放置一周后使用；0.4 mol/L TCA；福林酚试剂；0.4 mol/L NaOH 溶液；0.4 mol/L Na2CO3溶液；西红柿浸出液；肝提取液。

1.2 仪器与设备

台式大容量通用冷冻离心机（Eppendorf 5810R）、高压灭菌锅（YAMATO SQ510C）、电子天平（JA2003、YP- B2002）、气浴恒温振荡器（SHZ-82）、电热恒温培养箱（HH·BII·500-S）、电子恒温水浴锅（DZKW-4）、电热恒温水槽（SSW-420-2S）、可调式封闭电炉（FL-1）、纯水仪（ELGA PC120COBPM1）、722 型可见分光光度计、78-1 型磁力加热搅拌器等。

1.3 方 法

1.3.1 鱼肠道内容物的提取将采集的草鱼和鲫鱼用丁香酚麻醉后称重、取样，先用无菌棉花将体表水擦拭干净，然后用沾有浓度为75%酒精的棉球擦拭鱼体表面进行消毒，随后采用无菌操作的方式用解剖剪从鱼体肛门沿腹部向上剪开。待腹部完全剪开后，用镊子剥离出鱼的消化道，同时用沾有75%酒精的棉球擦拭消化道外壁。此后，用剪刀分离出中肠，采集各组的肠道内容物，并将同种鱼类的肠道内容物进行称重、混匀。以上操作具体参照汪明等[5]的方法、在无菌条件下进行。

1.3.2 鱼肠道微生物数量的测定按组进行无菌操作[6]，称取一定量的鲫鱼和草鱼肠道内容物分别放入装有25 粒左右玻璃珠和90 mL 无菌水的三角瓶中，分别编号为1、2，之后放入摇床中，转速120 r/min振摇30 min，使微生物充分分散，待振荡结束后，取出混合液，采用10 倍梯度稀释法将菌液稀释至10-6。待稀释完毕后，选择合适的稀释度，采用稀释涂布平板法进行。细菌在37 ℃培养箱中培养24 h 后统计菌落数，真菌在30 ℃培养箱中培养96 h 后统计菌落数，乳酸菌和双歧杆菌均在37 ℃厌氧培养箱中培养48 h后统计菌落数，每一个稀释度设置3 次重复，求其平均值，并据此计算出每克肠道内容物中所含的菌数。

1.3.3 鱼肠道酶活性的分析在无菌条件下，取出鱼体内的肠道内容物、称重，随后将肠道内容物用无菌水稀释后装瓶，放置于温度为40 ℃的水浴锅中保温30 min，以充分溶出肠道内容物中所含的酶蛋白，待冷却，放入转速为2 000 r/min 的离心机中离心10 min后，取上清液，即为肠道酶液，备用。测试时，吸取肠道酶液，分别滴加到标记为纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶的试管中，经操作后测定上述4 种酶的活性，各设3 次重复。肠道纤维素酶活性、肠道淀粉酶活性以及肠道木聚糖酶活性的测定均采用DNS比色法进行，纤维素酶活以1 g 肠道内容物中的酶在46 ℃作用30 min 生成1 µg 还原糖定义为一个酶活单位（U），淀粉酶活以1 g 肠道内容物中的酶在37 ℃作用60 min生成1 µg还原糖定义为一个酶活单位（U），木聚糖酶活以1 g 肠道内容物中的酶在46 ℃作用60 min 生成1 µg 还原糖定义为一个酶活单位（U）；蛋白酶活性的测定采用福林-酚法进行，以1 g 肠道内容物中的酶在37 ℃作用40 min 生成1 µg 氨基酸定义为一个酶活单位（U）[6]。

1.3.4 鱼肠道微生物活度测定利用1.3.3 提取的肠道酶液，根据微生物活度的内涵，具体流程参照Schnürer J 和Rosswall T[7]的方法进行：取0.1 mL 浓度为2 mg/mL 的FDA 储存液加入到19.9 mL 磷酸盐缓冲液中，获得浓度为10 µg/mL 的A 液，向 A 液中加入0.2 mL 肠道内容物酶提取液，得到混合液，然后将混合液放入24 ℃的气浴恒温振荡器中，振荡培养90 min 后取出，并加入等体积的丙酮以终止反应。经3 µm 滤纸过滤，放入6 000 r/min 离心机中离心5 min 后重新取出，在490 nm 测定OD 值，每个样本重复测定3 次，记录并分析数据。

1.3.5 统计学分析用SPSS 21.00 软件进行数据处理。各分组所得数据采用平均值±标准差表示，两组间均数比较若符合正态性、方差齐性则用独立样本t检验，否则采用非参数秩和检验。P＞0.05 表示差异不显著，P＜0.05 表示有显著性差异，P＜0.01 表示有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 鲫鱼和草鱼的肠道微生物区系结果

微生物区系是特定环境中微生物的数量与种类的组成。由表1 可见，鲫鱼和草鱼肠道内的细菌总数较接近，其中草鱼肠道内的真菌与双歧杆菌数目均高于鲫鱼，鲫鱼肠道内的乳酸菌数目高于草鱼，但草鱼肠道的各微生物数目与鲫鱼相比差异无统计学意义（t细菌= -0.506，P细菌= 0.639；t真菌= -2.217，P真菌= 0.091；t乳酸菌= 3.692，P乳酸菌= 0.639；t双歧杆菌=-0.420，P双歧杆菌=0.696）。试验中发现，真菌菌落结构显示鲫鱼和草鱼的肠道真菌以青霉和曲霉等霉菌为主，几乎没有酵母菌（见图1），而小鼠肠道中含有比较多的酵母菌[8]。

图1 两种鱼类的肠道真菌菌落

表1 两种鱼类的肠道微生物区系结果

2.2 鲫鱼和草鱼的肠道主要消化酶活性特点

生物体的物质转化离不开酶的参与，从肠道消化酶的活性能直接反映机体消化能力以及间接反映肠道形态结构的完整性。由表2可见，鲫鱼肠道内的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和木聚糖酶活性均高于草鱼。除草鱼肠道内的淀粉酶与鲫鱼相比差异无统计学意义外（W淀粉酶= 47，P淀粉酶= 0.905 8），草鱼肠道内的蛋白酶、纤维素酶和木聚糖酶与鲫鱼相比差异均有统计学意义，且存在极显著差异（W蛋白酶= 21，P蛋白酶= 0.003 7；W纤维素酶=45，P纤维素酶= 0.000 3；W木聚糖酶= 45，P木聚糖酶= 0.000 3）。

2.3 鲫鱼和草鱼的肠道微生物活度

肠道微生物活度是肠道各类水解酶活性的总和，能够反映肠道对物质的水解情况。由表2 可见，草鱼肠道内的微生物活度明显低于鲫鱼肠道内的微生物活度，与鲫鱼相比差异有统计学意义，且差异极显著（WFDA= 45，PFDA= 0.000 3）。

表2 两种鱼类的肠道主要消化酶活性及肠道微生物活度

3 讨 论

3.1 鲫鱼和草鱼的肠道微生物区系特点

传统微生物培养法能够对特定的可培养微生物进行检测，在肠道微生物数量的测定中也具有重要的意义[9-10]。随着肠道微生物研究的深入，有关肠道微生物的应用必将关注可培养微生物。此研究发现草鱼肠道内霉菌数量明显高于鲫鱼肠道内霉菌数量，而乳酸菌数量却明显低于鲫鱼，这一发现与吴杰奇等[11]的研究结果一致。乳酸菌是动物肠道内已知的益生菌，具有抑制病原菌的黏附、定植和入侵的作用，在肠道免疫方面发挥着重要的作用[3]，鲫鱼肠道中乳酸菌的数量明显高于草鱼，这在一定程度上可解释鲫鱼抵抗能力强于草鱼。草鱼肠道中真菌数量较多可能与其摄入的食物种类有关，自然环境下，草叶、树叶等真菌含量较高，为草鱼肠道贡献了部分外源性真菌。有研究学者采用18S ITS 高通量测序的方法研究用构树叶投喂草鱼肠道真菌群落多样性，结果发现，构树叶组和配合饲料组肠道真菌群落结构有明显差异[12]。

肠道菌群种类繁多，数量庞大。培养技术对肠道中有益微生物的产品研发提供了重要参考，为其分离和培养奠定了基础。此研究使用的是可培养肠道微生物指标，但4 种可培养微生物的数目在两种鱼中差异并不显著，说明两种鱼在鱼病方面的差异很可能与其他的少数几种微生物有关[13-15]。因此，借助微生物培养技术只能粗略反映特定培养基和培养条件下生长的肠道微生物特征。随着现代分子生物学技术的发展，采用高通量测序技术能更全面、更客观地了解草鱼和鲫鱼肠道微生物特征[16]。

3.2 鲫鱼和草鱼肠道酶活性与食性的关系

肠道消化酶在营养物质吸收，机体免疫等方面发挥着重要作用，根据来源分为内源性消化酶和外源性消化酶。肠道微生物与消化酶有着重要的联系，饲料中添加益生菌能够提高鱼类的消化酶活性，使一些难消化的大分子物质分解成易被肠道细胞吸收的小分子物质，进而利于鱼类的生长[17]。一般而言，草食性鱼类含有相对较高的纤维素酶活性和淀粉酶活性，杂食性鱼类含有相对较高的蛋白酶活性和脂肪酶活性[18-19]。试验结果显示鲫鱼的蛋白酶显著高于草鱼，与之前的一些研究结果相吻合。但草鱼的淀粉酶和纤维素酶却低于鲫鱼，这一发现与一些研究结果相反。这可能与饲养环境、年龄等因素有关。例如在鱼体生长后期，鲫鱼和草鱼的成鱼均以植物性食料作为主要进食对象，故在一定程度上存在竞争关系[20]。此外，微生物活度的测定结果也与肠道酶活性的比较结果表现出一致性，猜测鲫鱼在相同条件下迅速生长发育成成鱼，即要求肠道内的多种水解酶具有较强的活性，从而提高鱼体对于饲料的利用率，以得到更多的水解产物，进而满足自身对于生长繁殖所需营养物质的需求。肠道微生物与酶活性的关联研究，对相关肠道调节剂的研发和使用具有较好的参考价值[21]。

4 结 论

试验结果表明，鲫鱼和草鱼在肠道微生物及酶活性方面存在一定的差异，草食性为主的鱼肠道内真菌数目高于杂食性鱼，而乳酸菌数目低于杂食性鱼，杂食性鱼肠道内多种酶活性高于草食性鱼。