华中地区水库型水源地抗生素抗性细菌的赋存特征研究

张凯 ，郭紫微 ，王倩 ，韩雅 ，李贶家，张中帅

1.信阳师范学院地理科学学院，河南 信阳 464000；2.河南省水土污染协同防治重点实验室/信阳师范学院，河南 信阳 464000；3.水利部发展研究中心，北京 100038

抗生素耐药性导致的环境问题近年来受到越来越多的关注（朱永官等，2018）。环境中残留的抗生素促进了环境中微生物抗药性的发展，导致环境中抗性细菌的大量繁殖（Jiang et al.，2018）。环境中的抗性细菌（Antibiotic resistant bacteria，ARB）会通过水平转移的方式将抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）传播到病原菌中，从而对人体健康产生威胁（Allen et al.，2010；Yang et al.，2018）。目前，针对各个环境介质中ARGs及ARB中的研究层出不穷。大量研究结果表明，空气、水及土壤等介质中均有不同程度的ARGs及ARB污染，环境中ARGs及ARB污染已不容忽视（Jiang et al.，2018；Yang et al.，2018；García et al.，2020）。

湖库型水源地与人体健康密切，其用水安全也是最引人重视的研究之一。Han et al.（2020）的研究结果表明，即便经过饮用水处理设施的深度处理，湖库型水源地中的菌落结构仍能够对饮用水中的菌群组成造成直接影响。这一结果进一步凸显了研究湖库型水源地环境中耐药菌的重要性。近年来，大量研究分析了湖库环境中ARGs及ARB污染现状（Pang et al.，2015；Nnadozie et al.，2019；Chen et al.，2019；Dang et al.，2020）。结果表明，湖库环境中也受到了一定程度的 ARB污染，且不同地区ARB的污染状况不尽相同。

华中地区为中国七大地理分区之一，其包括河南、湖北、湖南三省。该地区总面积约56×104km2，占全国国土总面积的约5.9%。截至2017年底，华中地区常住人口约2.23亿人，生产总值约11.61万亿元，人均生产总值约5.20万元。随着近年来华中地区经济的快速发展，该地区社会经济地位日益凸显。然而，经济及工业的高速发展造成了该地区环境质量的恶化（彭佳雯等，2011；缪羽晨等，2019）。水库是华中地区最重要的饮用水来源，在促进该地区经济发展和繁荣、保障居民身体健康方面的作用不可替代。然而，目前缺乏对该地区供水水库ARB赋存状况综合性的调查。因此，亟需研究明确华中地区水库型水源地 ARB的分布特征，为控制该地区水库环境 ARB及抗生素污染提供理论依据及数据支撑。

基于以上背景，本研究选取了华中地区 11个大型水库型水源地，分析了水样和底泥中耐药菌的分布规律。本研究的主要目标有：（1）明确华中地区水库型水源地中耐药细菌的污染特征；（2）分析华中地区水库型水源地不同环境介质中耐药细菌的分布差异。

1 材料与方法

1.1 主要实验仪器及试剂

本实验所用仪器包括：BSD-400恒温振荡培养箱（上海博迅实业有限公司），T100PCR扩增仪（美国Biorad），SW-CJ-1G无菌超净工作台（上海沪净医疗器械有限公司），YM75Z高压蒸汽灭菌器（上海三申医疗器械有限公司）。

本实验所用主要试剂包括：细菌基因组DNA提取试剂盒（美国Axygen），琼脂糖（北京鼎国生物有限公司），50×TAE（天津莫克曼生物科技有限公司），PCRmix（南京诺维赞生物科技有限公司），琼脂粉、酵母粉以及蛋白胨均购于北京奥博星生物技术有限公司），磺胺甲恶唑、氨苄西林、四环素、诺氟沙星以及链霉素均购于大连美仑生物技术有限公司。

1.2 水样和底泥的采集与保存

本研究从华中地区选取了 11个供水水库（图1），其中4个水库选自河南（HN1，HN2，HN3，HN4），3个水库选自湖北（HB1，HB2，HB3），4个水库选自湖南（HU1，HU2，HU3，HU4）。样品于2019年10—11月进行。采集样品时，每个水库库区分别设定一个 10000 m2的正方形区域，在该区域的4个顶点和中心位置各取1 L子水样和20 g左右的表层沉积物。从每个子样各取400 mL水和5 g沉积物样品，分别于2.5 L采样瓶中和无菌自封袋中混合均匀，在4 ℃条件下运至实验室。

图1 华中地区水库采样点示意图Fig.1 Sampling sites of water supply reservoirs in central China

1.3 水样和沉积物可培养细菌的计数

采用 10倍梯度稀释法对水样细菌进行培养以及计数。将每个取样点所取水样用无菌PBS稀释4个梯度，每个梯度设置3个平行。每个样品分取50 μL于LB固体培养基上涂布，于37 ℃培养48 h，随后取合适梯度对细菌进行计数。

以5 mL无菌离心管为容器，在无菌条件下准确称取0.2 g沉积物样品。随后向离心管加入2 mL无菌PBS溶液，充分混匀后吸取200 μL至新的5 mL无菌离心管中进行10倍梯度稀释。每个采样点稀释5个梯度，此后所有实验参数均与水样10倍梯度法相同。

1.4 抗生素耐药菌筛选

本研究选取的各类抗生素的最终浓度及参考文献如表1所示。

表1 抗生素浓度信息Table 1 Related information of antibiotic concentration in this study

水样和沉积物样品按照10倍梯度稀释法（0.5 mL+4.5 mL）分别稀释2个梯度和3个梯度，每个梯度分别设置3个平行，分别吸取50 μL样品均匀涂布于抗性平板上。以未添加抗生素的平板为对照，平板倒置于37 ℃条件下培养48 h，随后取合适梯度对细菌进行计数（刘珊珊等，2018）。

1.5 耐药菌株鉴定

从抗性平板上随机挑选菌落形态有明显差异的细菌进行划线培养（叶繁等，2019），将纯化后的单菌落接种到LB液体培养基中，于37 ℃条件下培养48 h，将菌液用细菌DNA提取试剂盒提取细菌DNA。采用Nanodrop 2000核酸蛋白定量仪测定提取DNA的质量以及纯度。以细菌基因组DNA为模板，采用25 μL体系对细菌的16S rDNA进行扩增。体系组成为：12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix，上、下游引物各 1 μL，1 μL DNA 模板，9.5 μL 双蒸水。正向引物序列27F为：5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′，反向引物1492R为：5′-ACGGTTACC TTGTTACGACTT-3′。PCR产物立即于低温条件下送往北京六合华大基因科技有限公司进行测序。测序结果在NCBI数据库中进行同源性比对，根据比对结果确定细菌种属。

1.6 统计学方法

实验数据采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。利用独立样本t检验进行差异性分析，P<0.05为差异有统计学意义。热图、相关性热图分别用R 3.6.1的 ggplot2及 ggcorrplot包绘制；mantel分析用 R 3.6.1的vegan包进行。

2 结果与讨论

2.1 华中地区水库型水源地上覆水中抗生素抗性细菌的分布特征

华中地区水库型水源地 ARB的分布特征如图2所示。各省水库上覆水和沉积物中ARB分布不存在显著性差异（t检验，P>0.05），表明华中地区水库型水源地上覆水中ARB分布不存在地域性差异。华中地区各省的养殖业均比较发达。2016年华中地区各省猪、牛和羊的总量占全国总量的比例均比较接近。抗生素在养殖业的使用是造成环境中细菌耐药性的重要因素。因此，华中地区相近的养殖业规模导致了该地区水库中ARB不存在地域性差异。

图2 华中地区水库型水源地抗生素抗性细菌的分布特征Fig.2 ARB distribution pattern in water supply reservoirs of central China

上覆水和沉积物中丰度最高的两类 ARB均是磺胺类 ARB（上覆水中平均相对丰度为 8.9%，在所有耐药菌中的占比为45%；沉积物中平均丰度为7.0%，占耐药菌总量的 54%）和 β-内酰胺类 ARB（上覆水中平均丰度为8.1%，在所有耐药基因中的占比为38%；沉积物中平均丰度为3.2%，占耐药菌总量的 27%），这可能与其对应抗生素的使用及特性有关。磺胺类抗生素有较长的使用历史且仍是目前使用量最大的抗生素之一，每年有将近2000 t磺胺类抗生素被释放到生物圈（Qiu et al.，2006）。此外，其具有较好的水溶性且难以降解，因此可以在环境中持续积累并提供选择性压力（Zhang et al.，2020）。此外，以氨苄青霉素为代表的β-内酰胺类抗生素近年来在医疗和畜牧业中被广泛使用，Zhang et al.（2015）的研究结果表明，中国β-内酰胺类抗生素使用量为 34100 t，占中国抗生素总使用量的21%。因此，磺胺类和β内酰胺类抗生素的大量使用可能是导致水库上覆水中 ARB广泛存在的重要因素。

喹诺酮类ARB在本研究选取的5种抗生素中丰度最低，这可能和喹诺酮类抗生素本身的性质有关。排放到环境中的喹诺酮类抗生素并不稳定，光照、水和生物作用均能促进其降解。此外，水体环境中喹诺酮类抗生素能通过吸附作用蓄积于沉积物中（孟磊等，2015）。以往关于水库环境中抗生素的研究表明，喹诺酮类抗生素平均浓度低于四环素和大环内酯类抗生素（廖杰等，2020）。因此，水库中喹诺酮较低的含量可能是导致相应 ARB丰度较低的重要因素。与上覆水相比，沉积物四环素类抗生素占比增高，这可能和沉积物对四环素有较强的吸附性能有关。土壤对四环素类抗生素的吸附能力和吸附容量高于其他类别的抗生素（伊丽丽等，2013），导致沉积物中ARB丰度相应增加。

2.2 沉积物和上覆水中耐药菌的丰度关系

由图2可知，本研究选取的ARB在大部分采样点均能检出，且当ARB在水库上覆水中检出时，其在沉积物中也往往能被检出。该结果表明，上覆水与沉积物 ARB的赋存特征存在较强联系。在此基础上，本研究进一步采用了mantel分析评估了沉积物和上覆水中 ARB的丰度关系。结果表明，华中地区水库型水源地沉积物和上覆水中 ARB丰度呈显著性正相关（r=0.472，P=0.026，permutations=9999），表明水库沉积物和上覆水ARB组成相似。沉积物是污染物的“汇”和“源”，包括ARB在内的污染物通过吸附、沉降等作用汇集在沉积物上（姜春霞等，2019）。当水体发生扰动时，吸附于沉积物中的污染物又重新释放到上覆水中（张皓清等，2020）。相对于河海等环境介质，湖库环境水体流动相对缓慢，沉积物和水交换能力也相对较弱。但湖库有增强水和沉积物之间物质交换的途径。本研究样品采集工作于10月及11月进行，昼夜温差较大，因此易造成“翻湖”现象，该途径能够增强水和沉积物之间的物质交换（陆桂华等，2009）。

本研究通过 Spearman相关性分析探索了不同类别ARB的共现关系，结果如图3所示。结果表明，多数耐药菌之间都具有一定的正相关关系。其中四环素类ARB及氨基糖苷类ARB均与三类耐药基因有显著性正相关。有研究表明，中国往往采用数种抗生素联用的方式治疗疾病（Qiao et al.，2018）。因此，环境中不同种类抗生素的共选择作用是不同类别ARB丰度具有相关性的因素之一。

图3 不同类别ARB的共现关系Fig.3 Co-occurrence patterns among different ARB types

2.3 菌种鉴定结果

本研究根据细菌形态的不同，选取了 26 个菌株进行菌种鉴定，共鉴定出8种菌属。其中气单胞菌属（Aeromonas，9株，34.6%）及不动杆菌属（Acinetobacter，7株，26.9%）检出率最高。此外，肠杆菌属（Enterobacter）、芽孢杆菌属（bacillus）以及假单胞菌属（Pseudomonas）均检出2株；希瓦氏菌属（Shewanella）、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）以及类芽孢杆菌属（Paenibacillus）均检出1株。气单胞菌属、不动杆菌属以及芽孢杆菌属均为人体条件致病菌，在人体免疫力下降时能够引起人体胃肠道、肺部感染（叶繁等，2019）。本研究筛选的气单胞菌属及不动杆菌属均对3种以上抗生素有抗性，这两种菌属的多重抗性可能会对人体健康产生威胁。此外，本研究还筛选出了能够与人体肠道密切相关的肠杆菌属细菌，两株细菌均分离自沉积物中，表明水库沉积物一定程度上受到粪源污染。两株细菌分别对磺胺类抗生素及四环素类抗生素表现出耐药性，表明陆源输入也可能是导致水库 ARB细菌广泛分布的原因之一。

本研究同时对水样和沉积物细菌总数（Total heterotrophic bacteria count，HPC）进行了计数（表2）。结果表明华中地区供水水库 HPC低于山东省湖泊环境（钱岩等，2013）及华中地区非供水湖泊（孙增灵等，2011）中HPC数量。中国饮用水标准规定 HPC 总量不得超过 1.00×102CFUs·mL−1。以往研究表明，饮用水处理工艺对细菌的去除效果极为明显（Zhang et al.，2020）。因此，虽然华中地区供水水库受陆源输入细菌影响，但华中地区水库型水源地较少的细菌数量能够在一定程度上保证饮用水水质。

表2 华中地区水库上覆水和沉积物的总异养菌数Table 2 Total heterotrophic bacteria count of water supply reservoirs in central China

3 结论

（1）磺胺类和四环素类 ARB是华中地区水库型水源地丰度最高的两类ARB。

（2）华中地区水库型水源地沉积物和上覆水中的ARB含量没有显著性差异。

（3）华中地区水库型水源地多数耐药菌之间具有一定的共现关系。

（4）水库型水源地的一些条件致病菌具有3种以上多重抗性，由此导致的潜在风险值得关注。