耕作方式对植烟土壤酚酸类物质的影响

方宇 邓小鹏 张留臣 封幸兵 王皓 李庆鹏 周彬 陈峰 王津军 张晗 李卫 陈小龙 黄飞燕 余磊 童文杰 刘佳妮

摘要 [目的]明確不同耕作方式对植烟土壤酚酸类物质积累特征的影响，为缓解其自毒化感作用提供理论依据。[方法]以烤烟“K326”为研究材料，进行大田试验，以旋耕20 cm（RT20）为对照，利用高效液相色谱法（HPLC）检测旋耕20 cm（RT20）、翻耕30 cm（DT30）、深松30 cm（ST30）和深松40 cm（ST40）下酚酸类物质的种类和含量，并基于相关性分析和逐步回归模型探讨各酚酸类物质的积累特征及其影响。[结果]不同耕作方式下共检出6种酚酸，对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸、阿魏酸和酚酸总量在DT30处理下含量较低，较RT20分别低13.77%、68.87%、25.81%、19.83%、20.54%、27.09%，且香草酸达到显著差异（P<0.05）;除肉桂酸外各酚酸类物质含量均随土层的加深逐渐降低，ST40下对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸、阿魏酸和酚酸总量较ST30分别低16.41%、8.39%、17.85%、18.57%、35.68%、26.18%;同在30 cm耕作土层中，除肉桂酸外各酚酸含量均表现为DT30

关键词 耕作方式;植烟土壤;酚酸类物质;积累特征;高相液相色谱法;影响

中图分类号 S-153  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2021）13-0080-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.13.020

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effects of Tillage Methods on Phenolic Acids in Tobacco Planting Soil

FANG Yu1，DENG Xiao peng2，ZHANG Liu cheng3 et al

（1.Yunnan Urban Agricultural Engineering & Technological Research Center， College of Agronomy， Kunming University， Kunming，Yunnan 650214;2.Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences， Kunming，Yunnan 650201;3.China National Tobacco Corporation Yunnan Company， Kunming，Yunnan 650011）

Abstract [Objective]To clarify the effect of different tillage methods on the accumulation characteristics of phenolic acids in tobacco planting soil， and to provide a theoretical basis for alleviating its autotoxic allelopathy. [Method]Using flue cured tobacco “K326” as the research material， field experiment was conducted， rotary tillage 20 cm （RT20） was used as a control， high performance liquid chromatography （HPLC） was used to detect rotary tillage 20 cm （RT20） and tillage 30 cm （DT30）， deep pine 30 cm （ST30） and deep pine 40 cm （ST40） types and contents of phenolic acids， and based on correlation analysis and stepwise regression model to explore the accumulation characteristics of phenolic acids and their effects. [Result]A total of 6 phenolic acids were detected under different tillage methods. The total amount of p hydroxybenzoic acid， vanillic acid， syringic acid， 4 coumaric acid，ferulic acid and phenolic acid were all lower in DT30 treatment. RT20 was 13.77%， 68.87%， 25.81%， 19.83%，20.54% and 27.09% lower， respectively， and vanillic acid reached a significant difference （P<0.05）; except for cinnamic acid， the content of phenolic acids decreased gradually with the deepening of the soil layer， the total amount of para hydroxybenzoic acid， vanillic acid， syringic acid， 4 coumaric acid， ferulic acid and phenolic acid in ST40 were 16.41%， 8.39%， 17.85%， 18.57%， 35.68%， 26.18% lower than ST30 respectively.Except for cinnamic acid， the content of each phenolic acid in the 30 cm cultivated soil layer was DT30

Key words Tillage methods;Tobacco planting soil; Phenolic acids; Accumulation characteristics; High phase liquid chromatography;Effect

烟草是我国重要的经济作物之一，在全国各省均有种植，每年税收占全国总税收的1/10，是各级财政的重要组成部分[1]。玉溪是云南省清香型优质烤烟的代表产区，有“云烟之乡”美称，玉溪地处云贵高原西缘，地形复杂，山地面积占90.6%[2]，决定了玉溪地区主要以山地烟田进行种植，且旋耕、翻耕是其主要的耕作方式。旋耕、翻耕使得土壤耕层浅耕性退化、水土流失、有机质含量降低、生物活性降低等问题突出，最终导致烟草的产量和质量下降，严重制约着烟草产业的健康发展。土壤酚酸类物质主要来源于植物根系分泌，被土壤和作物根系吸收后产生化感作用[3-4]，其作用强度取决于其在土壤中的积累、降解以及相互之间的作用关系[5]。不同耕作方式对土壤扰动程度的差异，将会导致土壤中微生物和土壤理化性质的变化，进而影响土壤中酚酸类物质的积累和降解[6-7]，其在土壤中的吸附、滞留、转化直接影响化感作用的效果[8]。因此，从耕作方式的角度探究酚酸类物质的积累特征并寻求缓解措施具有重要的理论与实际意义。耕作方式是改善土壤质量的一种最为直接有效的方法。有研究表明，深耕和秸秆还田处理能够显著降低土壤容重、提高土壤通气孔隙和烟叶的质量与产量[9]。对于以叶片为收获器官，在生产过程中力求生长发育水平和品质平衡的烟草来说，适宜的耕作方式尤为重要。刘棋等[10]研究表明深耕、深松能够有效改善土壤物理性状，促进烤烟根系生长，优化根系空间分布。

土壤酚酸类物质是烟草连作障碍中的重要影响因子，目前，其积累特征已在水稻、花生、大豆等作物中予以明确，在烟草根际分泌物中也鉴定出多种酚酸，对土壤中的微生物、酶活性及养分产生不同程度的影响，并通过外源添加酚酸探讨了其化感作用机制[11-14]。此外，酚酸类物质对植株的致病机制、种子的萌发和胚根的生长产生重要的影响，能够在连作条件下间接地促进部分土传病害的繁殖，提高作物的发病率[15-16]。相关研究指出，香豆酸能够调节微生物种群结构，抑制尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和黄萎病菌（Verticillium dahliae）的生长[17];酚酸类物质对烟草黑胫病菌菌丝生长和孢子囊生长量均呈现出低浓度促进、高浓度抑制[18];且各酚酸之间存在一定的促进或抑制作用，影响酚酸的积累效应[19]。由此可见，酚酸类物质对烟草的健康生长具有重要的影响。

目前对于酚酸类物质的研究主要集中在分离与鉴定和连作障碍，而其在不同耕作方式土壤中的变化规律及相互作用关系鲜见报道[20]，因此，探明耕作方式对植烟土壤中酚酸类物质积累的影响并采取有效的耕作方式缓解连作障碍和化感作用是烤烟健康生产的关键。该试验采用HPLC对4种耕作方式下植烟土壤酚酸类物质的种类和含量进行检测分析，探究4种耕作方式对植烟土壤酚酸类物质的影响，挑选出对玉溪山地烟区烤烟的提质增效有重要作用的耕作方式;同时，在相关性分析的基础下，利用逐步回归方程模型研究不同耕作方式下植烟土壤中各酚酸类物质的相互影响关系，为研究酚酸类物质在不同耕作方式中的作用机理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2018年3—9月在玉溪市红塔区高仓街道（24°30′N，103°32′E）进行。试验地为云南省滇中烟区典型的山地烟种植区域，年降雨量为779.5～989.7 mm，年无霜期为244～365 d，年平均气温15.6～23.8 ℃，年日照时数2 115～2 285 h，海拔为1 760 m，土壤类型为红壤土，前茬作物为小麦。0～20 cm土层土壤翻耕前的基本理化性质为全氮0.75 g/kg、全磷1.28 g/kg、全钾7.7 g/kg、有效磷37.4 mg/kg、有机质17.8 g/kg、速效钾204 mg/kg、pH 6.72。

1.2 试验设计

试验所需的烟草品种为当地常规烤烟栽培品种 “K326”。整个试验共设置4种耕作方式处理，采取单因素随机区组试验，4种处理分别为旋耕20 cm（RT20，对照）、深耕30 cm（DT30）、深松30 cm（ST30）、深松40 cm（ST40）。旋耕20 cm：利用旋耕机刀片切削、打碎土块，疏松混拌耕层土壤，旋耕深度为20 cm;深耕30 cm：通过904东方红拖拉机三点悬挂铧式犁深翻耕地，深耕深度30 cm;深松30 cm（40 cm）：通过904东方红拖拉机三点悬挂凿式深松铲疏松土壤而不翻转土层，同时利用拖拉机液压控制深松机高度，控制深松深度为30 cm（40 cm）。深耕、深松完成后，对烟田进行细耙整地。每个处理进行3次重复，共12个小区，每个小区面积7.2 m×15.0 m。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 试验仪器。

Waters 2695高效液相色谱仪;色谱柱为 ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）;Waters 2487可变波长检测器;Empower色谱数据工作站;高纯水制备仪。

1.3.2

试验药剂。阔马酸（批号 U4CGB-MC）、对羟基苯甲酸（批号 CB27）、香草酸（批号 DM29）、丁香酸（批号 CL28）、4-香豆酸（批号 C10067978）、阿魏酸（批号 1709277）、肉桂酸（批号 110786-201604），纯度均大于98%。流动相甲醇为色谱醇，液相色谱用水为高纯水。

1.3.3 试验方法。

土壤酚酸类物质的测定采用HPLC进行测定，对供试烤烟根际土壤进行风干，去除须根等杂物，过40目筛，分别称取50 g土样于250 mL具塞锥形瓶中，加入150 mL 2 mol/L NaOH，120 r/min 振荡提取3 h，静置3 h，用滤纸过滤。取上清液用5 mol/L HCl調节pH至2.5。然后用乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取液，45 ℃蒸干，用5 mL 色谱纯甲醇溶解残渣，4 ℃避光保存，过0.22 μm滤膜，待测。

流动相A（0.3%乙酸水溶液）和流动相B（甲醇）设置的具体梯度为：0 min，A 95%，B 5%;1 min，A 80%，B 20%;5 min，A 70%，B 30%;7.5 min，A 20%，B 80%;10 min，A 95%，B 5%。流速0.3 mL/min;柱温35 ℃。精密称定阔马酸0.010 2 g、对羟基苯甲酸0.010 1 g、香草酸0.010 2 g、丁香酸0.010 2 g、4-香豆酸0.010 2 g、阿魏酸0.010 2 g、肉桂酸0.010 2 g为标准品，置于同一100 mL容量瓶中，用99.9%的色谱级甲醇精确定容，配制100 mg/kg的混合标液，于4 ℃避光保存，待用。进样量为10 μL。每个样品分析结束后，延迟1 min。

1.4 数据分析

利用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析;利用逐步回归模型对酚酸类物质间的相互作用进行分析。

2 结果与分析

2.1 土壤酚酸类物质及其含量变化特征

进样标准品分别为阔马酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸、阿魏酸、肉桂酸（图1），在RT20、ST30、ST40、DT30这4种耕作方式下的土壤中分别检出对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸、阿魏酸、肉桂酸（图2）。

2.1.1 不同耕作方式下对羟基苯甲酸的含量变化特征。

从图3可以看出，4种耕作方式下对羟基苯甲酸含量变化特征依次表现为ST30>ST40>RT20>DT30。在ST30时其含量最高，高达1.280 μg/g，在DT30时其含量最低，为0.877 μg/g;DT30处理下的对羟基苯甲酸含量较ST30、ST40、RT20分别降低了31.48%、18.04%、13.77%;同在30 cm的耕作深度下，DT30处理下的对羟基苯甲酸含量较ST30处理下降了31.48%，且两处理之间存在显著差异（P<0.05）;在同一深松处理下，对羟基苯甲酸含量表现为随着土层深度的增加呈逐渐减少的趋势，其中ST40处理较ST30处理降低了16.41%，且两者之间无显著差异（P>0.05）;另外，与RT20处理对比，DT30处理使对羟基苯甲酸含量有所降低，而ST30、ST40处理未使得其含量降低。

2.1.2 不同耕作方式下香草酸的含量变化特征。

从图4可以看出，香草酸经过4种耕作方式处理，香草酸的含量变化特征依次表现为RT20>ST30>ST40>DT30。在RT20处理下其含量最高，高达1.757 μg/g，在DT30时其含量最低，为0.547 μg/g;DT30处理香草酸含量较 RT20、ST30、ST40分别下降了68.87%、47.25%、37.42%，其中与RT20处理之间存在显著差异（P<0.05）;同在30 cm的耕作深度下，DT30处理较ST30处理下降了47.25%，但两处理间无显著差异（P>0.05）;在同一深松处理下，ST40处理较ST30处理降低了8.39%，两处理间无显著差异（P>0.05）;与RT20处理相比，ST30、ST40、DT30的香草酸含量在不同程度下均有所降低。

2.1.3 不同耕作方式下丁香酸的含量变化特征。

从图5可以看出，4种耕作方式下丁香酸含量变化特征表现为 ST30>RT20>ST40>DT30。其中，丁香酸在ST30处理时达到最高值（1.367 μg/g），在DT30处理下表现为最低（0.957 μg/g），DT30处理丁香酸含量较 RT20、ST30、ST40分别降低了25.81%、29.99%、14.78%，各处理之间无显著差异（P>0.05）;同在30 cm耕作深度下，DT30处理较ST30处理丁香酸含量降低了29.99%;在同一深松处理下，丁香酸含量表现为随着土层深度的增加而逐渐降低的趋势，ST40处理较ST30处理其含量降低了17.85%;与RT20相比，DT30处理下丁香酸含量降低幅度最大。

2.1.4 不同耕作方式下4-香豆酸的含量变化特征。

从图6可以看出，在4种耕作方式下4-香豆酸含量均无显著差异（P>0.05）。在4种耕作方式下4-香豆酸含量表现为ST30>ST40>RT20>DT30。4-香豆酸在ST30时其含量最高（4.953 μg/g），在DT30时其含量最低（3.020 μg/g），且DT30处理4-香豆酸含量较RT20、ST30、ST40分别降低19.83%、39.03%、25.12%;同在30 cm 耕作深度下，DT30处理的4-香豆酸较ST30处理降低了39.03%;在同一深松耕作方式下，4-香豆酸的含量表现为ST30>ST40;与RT20处理比较，在其他3种耕作方式中，只有DT30处理使4-香豆酸含量有所降低。

2.1.5 不同耕作方式下阿魏酸的含量变化特征。

从图7可以看出，在4种耕作方式下阿魏酸含量表现为RT20>ST30>DT30>ST40。在RT20处理下其含量表现最高（1.217 μg/g），在ST40处理下其含量表现为最低（0.757 μg/g）;4种耕作方式下阿魏酸含量无显著差异（P>0.05）。同在30 cm耕作深度下，2种耕作方式阿魏酸含量表现为ST30>DT30;在同一深松处理下，ST40处理阿魏酸含量较ST30处理下降了35.68%;与RT20相比，DT30、ST30、ST40处理均在一定程度下使阿魏酸含量有所下降，分别降低了20.54%、3.29%、36.89%。

2.1.6 不同耕作方式下肉桂酸的含量变化特征。

从图8可以看出，4种耕作方式下肉桂酸含量变化特征表现为DT30>ST40>ST30>RT20。其中，肉桂酸含量在DT30处理时达到最高（0.277 μg/g），在RT20时其含量表现为最低（0.063 μg/g），且各种耕作方式之间无显著差异（P>0.05）;在同一深松耕作方式下，ST40的含量略高于ST30;同在30 cm耕作深度下，ST30處理下肉桂酸含量较DT30降低24.22%;与RT20处理相比较，DT30、ST30、ST40处理中肉桂酸的含量均有所增加。

2.1.7 不同耕作方式下酚酸类物质总含量的变化特征。

从图9可以看出，酚酸类物质总量在4种不同的耕作方式下无显著差异（P>0.05）。4种耕作方式下酚酸类物质总量变化趋势表现为ST30>RT20>ST40>DT30。ST30处理时其含量最高（10.037 μg/g），DT30处理时其含量最低（6.643 μg/g），DT30处理中酚酸类物质总量较RT20、ST30、ST40分别降低27.09%、33.81%、18.66%;同在30 cm耕作深度下，DT30较ST30降低了33.81%;在同一深松耕作下，ST40较ST30下降了1.870 μg/g。与RT20相比，DT30和ST40均能使酚酸类物质总量有所降低，而ST30反而使總含量有所增加。

2.2 基于逐步回归模型的酚酸类物质的相互影响关系分析 为了进一步了解测得的6种酚酸类物质含量之间的相互作用关系，对6种酚酸物质的相关性进行分析。结果表明（表1），不同酚酸类物质之间有所差异，其中对羟基苯甲酸与丁香酸和酚酸总量呈极显著正相关（P<0.01），与4-香豆酸呈显著正相关（P<0.05）;丁香酸与4-香豆酸呈显著正相关，与酚酸总量呈极显著正相关;4-香豆酸与酚酸总量呈显著正相关;其余酚酸类物质之间的相关性均不显著。

逐步回归分析的标准化系数的正负表示自变量对因变量起到促进或抑制作用，标准化系数的大小则表示对应的自变量影响力的大小。基于相关性分析，对各酚酸物质间的相互作用进行逐步回归分析，共筛选出对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸、肉桂酸（表2），表明这5种酚酸类物质的含量受其他酚酸类物质的影响，而阿魏酸的含量不受其他酚酸类物质的影响或者影响不显著。其中，丁香酸和4-香豆酸对对羟基苯甲酸均有一定的促进作用，且丁香酸的促进作用大于4-香豆酸;而香草酸则抑制对羟基苯甲酸含量;丁香酸对香草酸具有促进作用，而肉桂酸则相反，且促进作用大于抑制作用;对羟基苯甲酸和香草酸对丁香酸均具有一定的促进作用，且对羟基苯甲酸的影响力较大;对羟基苯甲酸对4-香豆酸具有一定的促进作用;香草酸、丁香酸对肉桂酸分别具有一定的抑制、促进作用，且抑制作用大于促进作用。

3 讨论

酚酸类物质是一类重要的次级代谢产物，广泛存在于高等植物中，与植物的生长密切相关，被认为是最主要的化感自毒物质[21]，其进入到土壤中后能够被微生物利用、土壤吸附或者在微生物的作用下转化为其他物质。该研究发现，各酚酸类物质含量在4种耕作方式下呈现一定的差异。DT30与RT20相比，除肉桂酸外其余各酚酸类物质含量均有所降低;ST30、ST40与RT20相比，部分酚酸类物质含量有所下降，这说明3种耕作方式在一定程度上能够有利于酚酸类物质含量的降低。前人研究发现深翻与深松能够有效打破犁底层、增加土壤孔隙、降低土壤容重、改善土壤水分传导性能，使得微生物数量明显升高[22-23]，而微生物能够将酚酸作为碳源进行利用，微生物数量越多其降解速率越快，这与该研究结果一致。RT20耕作需要对土块进行打碎和疏松混拌使土壤表层的动植物残体、腐殖质等物质重新混合分布，致使有机质含量降低，有机质含量越低越有利于肉桂酸的降解，这与李亮亮等[5]对酚酸类物质在土壤中降解的研究结果一致。此外，除肉桂酸外，各酚酸类物质含量及酚酸总量均呈现出随着耕作土层深度的加深而逐渐降低，呈现出一定的层次性，不同的耕作方式对土壤表层的扰动程度较大，而对于土壤亚表层或者更深的土层扰动相对较小，使得深层土壤中养分、酶活性以及微生物活性变化不大，随着耕作土层的加深，植物根系和作物残体逐渐减少，使得酚酸物质的来源减少，而pH随着土层的加深逐渐升高促进了酚酸物质的降解，从而使酚酸类物质在深层土壤中含量较低。这与及利等[12，24-25]相关研究中酚酸类物质的含量在不同土层中的分布规律一致。同在30 cm土层中，DT30耕作方式下酚酸类物质的含量较ST30低，这与2种耕作方式的差异存在一定的联系，与ST30相比，DT30需要对土壤进行翻转，而ST30则不需要，造成作物残余物、动植物分解物质等累积在土壤表层而对于土壤亚表层的影响较少[6]，DT30通过翻转土壤能够保持土壤疏松和适宜水分，表层养分被翻压到土壤下层，改善了土壤结构和微生物群落结构，有利于微生物的繁殖和pH的升高，提高了酚酸类物质在土壤中的降解速率，使得其含量较ST30低。阿魏酸是烟草根系分泌的主要酚酸，但在4种耕作方式下，4-香豆酸的含量却比阿魏酸的含量高，土壤对4-香豆酸和阿魏酸吸附能力的不同可能是造成两者积累差异的原因之一[15]。

各酚酸类物质之间存在着一定的协同或抑制作用，对土壤中酚酸类物质的分泌与降解产生一定的影响[26]。该研究在相关性分析的前提下利用逐步回归方程模型确定了各种酚酸物质之间具有一定的相关性，在此基础上，以各种酚酸类物质为因变量，剔除相应的无关变量后，进一步得出各酚酸类物质之间具有一定的相互作用关系。结果表明，对羟基苯甲酸和丁香酸、香草酸和丁香酸、对羟基苯甲酸和4-香豆酸之间存在相互促进作用，香草酸与肉桂酸之间相互抑制，丁香酸对肉桂酸存在促进作用，香草酸对对羟基苯甲酸存在抑制作用;其中肉桂酸与香草酸、对羟基苯甲酸与丁香酸之间的影响力较大（标准化系数分别为-1.036、0.957）。李琳琳等[27]在探讨对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸同时作用时对棉花种子的萌发促进效果时发现这3种物质之间存在拮抗效应，Lyu等[28]在研究酚酸类物质的协同作用对黄瓜幼苗P吸收的影响时发现不同酚酸物质间存在拮抗效应，这与该研究的结果类似。但王璞等[29]通过外源添加酚酸对棉花种子萌发影响的研究中发现对羟基苯甲酸、阿魏酸、香草酸之间存在明显的促进作用，这与该研究结论相反，产生差异的原因可能是由于试验方法、气候条件、种植作物或土壤理化性质的不同而使结论产生差异。

4 结论

综上所述，在4种耕作方式下植烟土壤中的酚酸类物质含量存在差异，翻耕、深松能有效打破土壤犁底层降低土壤容重，影响土壤有机质转化和养分循环，同时翻耕、深松对土壤扰动较大，创造了不同的生态位，对烤烟根际微生态环境产生重要影响，有利于酚酸类物质含量的降低，且随着土层的加深，酚酸类物质含量逐渐降低且呈现出一定的层次性。上述结果为进一步研究耕作方式对土壤酚酸积累特征的影响提供了理论依据，但受研究手段的限制，只探讨了不同耕作方式下酚酸类物质的积累特征，而不同耕作方式下土壤酶活、微生物、农艺性状等与酚酸类物质的相互影响尚不完全清楚，仍需进一步研究。

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