黑毛石斛×鼓槌石斛杂交种组培快繁技术研究

田英男 张天泽 秦晓杰 冯垒 胡淞 师凯辉 黄鑫 韩欣妤 朱永平 和凤美

摘  要：本研究以黑毛石斛×鼓槌石斛杂交种蒴果为外植体，通过对种子无菌萌发和原球茎诱导、原球茎增殖及丛生芽诱导、生根壮苗以及移栽驯化研究，建立杂交石斛兰的组培快繁技术体系。结果表明，最适合种子无菌萌发和原球茎诱导的培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L+琼脂6.8 g/L+蔗糖20 g/L+马铃薯50 g/L;原球茎增殖及丛生芽诱导的最佳培养基为1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 1.0 mg/L+蔗糖25 g/L+琼脂6.8 g/L+碳粉1.0 g/L+马铃薯50 g/L+香蕉50 g/L，继代培养50 d，增殖系数达6.19;最佳生根壮苗培养基为1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+花宝1号0.5 g/L+蔗糖25 g/L+琼脂6.8 g/L+碳粉1.0 g/L+马铃薯50 g/L+香蕉50 g/L，培养2个月后，平均株高达7.14 cm，平均根数6.17条，平均根长6.46 cm，生根率达100%。体积比为单一松树皮和松树皮∶兰石=1∶1适于移栽，移栽65 d成活率分别达到96.32%和96.71%。

关键词：黑毛石斛;鼓槌石斛;杂交育种;组织培养

Abstract： In order to establish a rapid propagation for Dendrobium williamsonii × D. chrysotoxum， the immature hybrid seeds were selected as the explants to study the suitable medium for aseptic seed germination， protocorm-like bodies （PLBs） induction， proliferation of protocorm and shoot induction， rooting and growth and domestication by transplanting were also screened. MS + 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.3 mg/L + agar 6.8 g/L + sucrose 20 g/L + potato 50 g/L was the best medium for hybrid seeds germination and protocorm induction. 1/2 MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + KT 1.0 mg/L + sucrose 25 g/L + agar 6.8 g/L+AC 1.0 g/L + potato 50 g/L + banana 50 g/L was suitable for protocorm proliferation and shoot induction，and the proliferation coefficient reached 6.19 times after 50d. The best rooting and growth medium was 1/2 MS + 6-BA 0.2 mg/L + NAA 0.5 mg/L + Hyponex No.1 0.5 g/L + sucrose 25 g/L + agar 6.8 g/L + AC 1.0 g/L + potato 50 g/L + banana 50 g/L， cultivated for 2 months， root system was long and strong， plant height was 7.14 cm， average number of roots was 6.17， average root length was 6.46 cm， rooting rate was 100%. In the pine bark and mixture of pine bark∶orchid stone =1∶1 （V∶V）， after cultured for 65 d， the survival percentage was 96.32% and 96.71%， respectively.

Keywords： Dendrobium williamsonii; Dendrobium chrysotoxum; cross breeding; tissue culture

石斛屬（Dendrobium）是兰科中最大的一个属，其原种将近2 000种，13 600多个杂交种[1-3]。中国有74种，2变种[4]，分布于西南、华南、台湾等热带、亚热带和秦岭以南各地[5]，以附生为主，生存环境的气候一般都是比较湿润、温暖以及半荫的环境[6-7]。石斛属植物对生长环境要求比较苛刻，自然状态下生长较缓慢且繁育力极低[8-9]，加之具有较高观赏性和药用价值，长期被掠夺性采挖，对石斛属自然资源造成严重破坏，种质资源枯竭严重，培育石斛新品种已变得越来越重要。近年来，石斛杂交育种工作已开展，但报道仍较少[10-12]。

兰科植物繁殖主要靠分株繁殖，繁殖系数低、速度慢，不能满足日益增长的市场需求[13]。兰科植物也可以进行有性繁殖，主要靠昆虫授粉，但种子没有胚乳，且种皮致密，透性差，在自然条件下几乎不能萌发[14-15]，因此，主要靠人工授粉杂交培育出种子，再利用组织培养技术获得杂交苗[15-17]，但不同物种所需培养基不同，必须进行筛选优化。

黑毛石斛（Dendrobium williamsonii Day et. Rchb. f.）生长在海拔约1000 m的林中树干上，花期4?5月，具有较高的观赏价值[4]。鼓槌石斛（Dendrobium chrysotoxum Lindl）又名金弓石斛、粗黄草，花和茎可入药，是集食、药、观赏于一体的石斛品种，也是被《中国药典》收录的5种石斛之一[18]。

本研究以黑毛石斛（D. williamsonii）为母本，鼓槌石斛（D. chrysotoxum）为父本进行杂交，并建立种子组培快繁体系，有利于该石斛兰杂交种的应用与推广，同时对石斛兰的保育起到一定的作用。

1  材料与方法

1.1  材料

供试材料黑毛石斛和鼓槌石斛种植于云南农业大学园林园艺学院温室，2018年3—5月进行人工杂交授粉，10月进行采收。

1.2  方法

1.2.1  材料消毒与接种  取黑毛石斛×鼓槌石斛成熟蒴果，用洗洁精洗后，流水冲洗30 min，再用75%酒精浸泡5 min，无菌水冲洗2次，用0.1%升汞溶液浸泡消毒15 min，无菌水冲洗6～8次，无菌滤纸吸干，备用。

1.2.2  种子萌发和原球茎诱导  在1/3 MS、1/2 MS和MS培养基中添加6-BA 0.5 mg/L、NAA 0.3 mg/L、琼脂6.8 g/L和蔗糖20 g/L。用手术刀片划开蒴果，把种子均匀撒播于培养基中，每种配方播种5瓶。

1.2.3  原球茎增殖与丛生芽诱导  将萌发后的种子接种到原球茎增殖与丛生芽诱导培养基中，以1/2 MS为基本培养基，添加蔗糖25 g/L、马铃薯50 g/L、香蕉50 g/L、碳粉1 g/L、琼脂6.8 g/L。每组各5瓶，每个瓶内接180个原球茎，培养50 d后，统计原球茎增殖与分化结果。增殖系数=培养后原球茎总数/接种原球茎数。

1.2.4  无菌苗生根壮苗  取含2～3片叶、高2～ 3 cm苗转接到生根壮苗培养基中。培养基配方以1/2 MS为基本培养基，添加蔗糖30 g/L、马铃薯50 g/L、香蕉50 g/L、碳粉1 g/L、琼脂6.8 g/L。每组各5瓶，每瓶接种6株幼苗，培养60 d后，统计生根率、根长、株高等情况。平均生根数（条）= 生根根数/生根株数，平均根长（cm）=根长总和/根总数量，生根率=（生根苗数/全部苗数）100%。

1.2.5  培养条件  培养温度为（25±1）℃，光照强度为1500～2000 lx，光照时间为12 h/d，以上每个阶段pH为5.8。

1.2.6  移栽驯化  选用松树皮、水苔、椰糠、泥炭（德国进口）、兰石共5种基质，设置单一基质及2种复合基质共10种处理。将生长健壮的幼苗（株高为5 cm左右，含4～5片叶，长势大体一致）置于温室中炼苗7 d，再打开瓶口炼苗5 d，温度（25±1）℃。洗去培养基，用1 000倍多菌灵浸泡20 min，荫干后栽植于各基质中，每个处理30盆，每盆栽种3苗，65 d后统计成活率等指标。存活率=（存活苗数/全部苗数）×100%。

1.3  数据处理

采用Excel 2010软件对实验数据进行统计，采用DPS V9.50软件对各观测指标进行方差分析和极差分析。

2  结果与分析

2.1  不同因素对种子萌发和原球茎诱导的影响

种子在培养15 d后，培养基表面可见绿色点状物，表明种子在3种（1/3 MS、1/2 MS和MS）培养基中均能萌发，再经过35 d左右，原球茎形成。

其中在MS培养基（图1C）中原球茎诱导效果最好，原球茎颜色为深绿色，其次是1/2 MS培养基（图1B），诱导效果最差的是1/3 MS（图1A），原球茎诱导较少，原球茎颜色为黄色，甚至出现玻璃化现象，随着培养时间的增加这种现象更加严重。

A：杂交种子在1/3 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖20 g/L+马铃薯50 g/L中培养50 d;B：杂交种子在1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖20 g/L+马铃薯50 g/L中培养50 d;C：杂交种子在MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖20 g/L+马铃薯50 g/L中培养50 d。

2.2  不同激素配比对原球茎增殖与丛生芽诱导的影响

原球茎经过10 d的继代培养已经开始增殖（图2A），再经过15 d继代培养，6-BA、NAA和KT 3种激素不同配比的培养基均对黑毛石斛×鼓槌石斛杂交种原球茎产生了影响，原球茎增殖系数最高的前三组分别达到5.72、6.05、6.19，其中处理4的原球茎增殖系数最高（表1），达6.19（图2B），再经过25 d培养原球茎已经完全诱导成丛生芽（图2C）。

2.3  不同激素配比对生根壮苗的影响

由表2可知，经过60 d的培养后，杂交苗在9组培养基中均已生根，由方差结果可知，培养基對株高和平均根长影响达到极显著水平。其中处理4的无菌苗生长状况最好，株高7.14 cm，平均根数6.17条，平均根长6.46 cm（图2D，图2E）。

2.4  移栽驯化培养

由表3可知，在经历65 d的移栽培养后，经观察与统计，杂交种苗在10种不同基质中均能生长，在供试的5种单一基质中，试管苗的移栽成活率在76.16%～96.32%之间，其中水苔的最低，松树皮的最高;从株高情况看，在6.54～9.67 cm之间，以水苔的最低，松树皮的最好;从生长状况看，以松树皮为基质生长最好，叶片绿颜色有光泽，茎绿色粗壮，长势良好（图2F）。综合以上参数，松树皮是最适于黑毛石斛×鼓槌石斛杂交种试管苗移栽的单一基质。在试验的5个复合基质中，试管苗成活率在88.32%～96.71%之间，松树皮∶兰石=1∶1的存活率最高，为96.71%，其次分别为泥炭∶兰石=1∶1（成活率为93.68%）和松树皮∶泥炭=1∶1（成活率为92.37%），以松树皮∶椰糠=1∶1的存活率最低，为88.32%;从株高情况看，在8.36～9.75 cm之间，以松树皮∶椰糠=1∶1的最低，松树皮∶兰石=1∶1的最高;从生长状况看，表现最好的基质为松树皮∶兰石= 1∶1。综合以上参数，最适于黑毛石斛×鼓槌石斛杂交种试管苗移栽的复合基质为：松树皮∶兰石= 1∶1。

3  讨论

石斛属种间杂交及黑毛石斛组织培养相关报道较少，故本研究在铁皮石斛、鼓槌石斛和石斛属其他植物研究的基础上，从种子萌发和原球茎诱导、原球茎增殖和丛生芽诱导、生根壮苗、移栽驯化培养4个阶段进行了研究。

3.1  不同基本培养基对种子萌发和原球茎诱导的影响

随着石斛属以及兰科其他植物越来越多无菌播种技术的成功，通过无菌播种规模化快繁种苗更简单、快捷，而且育苗成本更低[19]。鉴于此，石斛属的无菌播种技术也受到了重视。仇硕等[20]认为在培养基中添加一定量的6-BA和NAA有利于种子萌发和原球茎的诱导。从研究结果来看，黑毛石斛×鼓槌石斛杂交种子的萌发较容易，其中以MS中添加蔗糖20 g/L和马铃薯50 g/L为基本培养基，再加入6-BA 0.5 mg/L、NAA 0.3 mg/L的种子萌发效果最好，并利于原球茎的诱导，这与前人的研究结果相似。在1/3MS和1/2MS培养基中出现的黄色原球茎和玻璃化现象有可能是由于培养基中的营养物质随着培养时间的增加消耗殆尽造成的。

A：原球茎在1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 1.0 mg/L+蔗糖25 g/L+碳粉1.0 g/L+马铃薯50 g/L+香蕉50 g/L原球莖增殖与丛生芽诱导培养基上培养10 d;B：原球茎在原球茎增殖与丛生芽诱导培养基上培养25 d;C：原球茎在原球茎增殖与丛生芽诱导培养基上培养50 d;D：组培苗在1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+花宝1号0.5 g/L+蔗糖25 g/L +碳粉1.0 g/L+马铃薯50 g/L+香蕉50 g/L培养基上生根壮苗培养60 d;E：无菌苗生根效果;F：在松树皮中移栽65 d的生长情况。

3.2  不同激素对原球茎增殖和丛生芽诱导的影响

原球茎增殖和丛生芽诱导阶段是石斛属植物扩繁的关键时期。采用激素处理是最常用的方法，通过一定量的生长素并添加细胞分裂素来提高增殖诱导效果。本研究结果表明，原球茎在以1/2 MS为基本培养基添加6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.2 mg/L、KT 1.0 mg/L及蔗糖25 g/L、马铃薯50 g/L、香蕉50 g/L、碳粉1 g/L、琼脂6.8 g/L的培养基中生长50 d，原球茎增殖系数达到6.19且丛生芽生长表现良好，适用于原球茎增殖和丛生芽诱导，这与王一诺等[21]认为重唇石斛原球茎增殖和丛生芽诱导的最佳激素组合为6-BA 2.0 mg/L+KT 0.2 mg/L+ NAA 0.4 mg/L得到的结果相似。

3.3  花宝一号对石斛杂交苗生根壮苗的影响

生根壮苗阶段是组织培养最重要的阶段之一，本研究在生根壮苗阶段添加了一定量的花宝一号（7N-6P-19K），其最早是用作兰科植物种子萌发的培养基[22]。在本研究过程中发现其有利于杂交种苗的生根壮苗，结果优于前人只使用NAA、6-BA的情况[23-24]，这与黄象男等[25]在蝴蝶兰生根壮苗阶段以花宝一号为基本培养基，添加NAA、6-BA，结果明显优于以1/2 MS、MS为基本培养基的其他组的结论相一致，表明花宝一号有利于植株生根壮苗，说明在使用NAA、6-BA基础上添加适量的花宝一号有利于石斛苗的生根壮苗。通过研究得出以1/2 MS为基本培养基，添加6-BA 0.2 mg/L、NAA 0.5 mg/L、花宝1号0.5 g/L，并加入蔗糖25 g/L、碳粉1.0 g/L、马铃薯50 g/L、香蕉50 g/L为石斛杂交苗壮苗生根的最适培养基，2个月后，平均株高、平均根数、平均根长等指标最好，生根率达100%。

3.4  石斛杂交苗移栽驯化过程中基质的选择

栽培基质的选择对于石斛苗的生长与发育影响较大，采用透气性好的树皮和兰石，保水性好的水苔、椰糠和泥炭作为单一基质，并根据它们的透气和保水的特性配制混合基质，保证石斛苗在不同基质中能正常生长。结合移栽后植株的生长状况和成活率来看，在单一基质中，以树皮为最佳，水苔最差，这与李蕾等[26]在鼓槌石斛移栽驯化过程中将水苔作为基质，获得了97%的成活率不一致，可能是因为水苔保水性较好，昆明地区在夏秋季阴雨天气较多，晴天时温室中更是高温高湿的环境，易引起植株根系和假鳞茎腐烂[27]，因而不适宜用水苔作为基质;椰糠在单一基质中表现也较差，可能是因为其保水性较好且在浸泡后盐分过高，对植物根系伤害较大的缘故。在混合基质中植株生长状况和成活率比单一基质都有不同程度提升，其中树皮∶兰石=1∶1最佳，其次是树皮∶泥炭=1∶1，泥炭∶兰石=1∶1，它们的保水和透水性都很高，且有很好的营养成分。因基质为单一树皮和树皮∶兰石=1∶1在成活率和株高差距不大且生长状况相同，综合成本考虑，采用树皮作为基质成本低，成活率高，生长状况良好，适合黑毛石斛×鼓槌石斛杂交苗的生长。

参考文献

Pridgeon A， Morrison A. The Illustrated Encyclopedia of Orchids - Over 1100 Species Illustrated and Identified[M]. Portland： Timber Press Lid， 2006： 87-103.

Wu Z Y， Raven P H， Hong D Y. Missouri Botanical Garden Press Flora of China （Vol. 25， Orchidaceae）[M]. Beijing： Science Press， 2009： 367-397.

王  雁， 周进昌， 郑宝强， 等. 石斛兰[M]. 北京： 中国林业出版杜， 2014： 2.

中国科学院中国植物志编委会. 中国植物志： 第19卷[M]. 北京： 科学出版社， 1999： 67， 133.

邹成勇， 刘  燕. 我国石斛属植物研究进展[J]. 安徽农业科学， 2010， 38（12）： 6164-6166， 6223.

杜佳林. 兰花育种现状及进展[J]. 广西热带农业， 2009（5）： 32-35.

郭丽霞， 莫  饶. 兰花育种研究现状及进展[J]. 广西农业科学， 2007（3）： 303-309.

李风童， 包建忠， 孙  叶， 等. 兰花种子萌发研究进展及对国兰杂交育种的启示[J]. 江苏农业科学， 2015， 43（10）：

13-16.

王卜琼， 李枝林， 余朝秀. 兰花育种研究进展[J]. 园艺学报， 2005（3）： 551-556.

符岸军， 李娟玲， 李劲松， 等. 石斛兰“绿色星辰×出水芙蓉”杂交种子无菌萌发与组培快繁研究[J]. 安徽农业科学， 2011， 39（5）： 2577-2580.

陈和明， 吕复兵， 李  佐， 等. 秋石斛兰F1代主要观赏性状的遗传表现[J]. 热带作物学报， 2016， 37（9）： 1664-1669.

朱胜蕾. 中国石斛属植物育种潜力研究[D]. 中国林业科学研究院， 2016.

范成明， 李枝林， 何月秋. 兰花组织培养及分子生物学研究进展[J]. 园艺学报， 2003（4）： 487-491.

丁秋露， 赵旵军. 兰花组织培养和分子生物学研究进展[J]. 生物学杂志， 2010， 27（2）： 76-79.

曾碧玉， 朱根发， 刘海涛. 兰花选育种研究进展[J]. 中国农学通报， 2005（12）： 272-276.

周  银， 徐嘉敏， 肖  政， 等. 兰花繁殖和育种研究进展[J]. 北方园艺， 2013（13）： 204-207.

吴根良， 商世能， 沈国正， 等. 兰花育种现代技术研究进展[J]. 杭州农业科技， 2006（3）： 25-28.

杜溶讫， 于增金， 殷  彪， 等. 鼓槌石斛研究进展[J]. 安徽农业科学， 2018， 46（23）： 6-8.

叶秀仙， 黄敏玲， 林榕燕， 等. 素心建兰无菌播种快繁技术研究[J]. 福建农业学报， 2015， 30（10）： 939-943.

仇  硕， 赵志国， 赵  健， 等. 翅萼石斛组织培养及快繁技术研究[J]. 广东农业科学， 2018， 45（9）： 48-52， 173.

王一诺， 李林轩， 韦  莹， 等. 不同浓度激素配比对重唇石斛组织培养的影响[J]. 北方园艺， 2016（10）： 148-151.

Nishimura G. Japanese Orchids[M]//Arditti J. Orchid Biology Ⅱ： Reviews and Perspectives， Orchid seed germination and seeding culture – a manual. Ithaca： Cornell University Press， New York， 1982： 331-346.

崔  波， 康莹莹， 王洁琼， 等. 鼓槌石斛组织培养及快繁技术研究[J]. 中国农学通报， 2015， 31（19）： 111-116.

徐  红， 刘  峻， 王峥涛， 等. 鼓槌石斛组织培养研究[J]. 中国中药杂志， 2001（6）： 18-21.

黄象男， 臧  新， 吕晓辉， 等. 蝴蝶兰组培快繁技术研究[J]. 河南农业科学， 2008（1）： 91-93， 109.

李  蕾， 刘  伟. 鼓槌石斛组培苗移栽试验[J]. 安徽农学通报， 2018， 24（Z1）： 63-64.

Zhou H， Gao Q， Gong Q F， et al. First report of stem and root rot of the medicinal herb Dendrobium officinale （Orchidaceae） caused by Ceratobasidium sp. AG-R in Guangxi， China[J]. Plant Disease， 2017， 101（9）： 1679-1680.

責任编辑：谢龙莲