芒果MiFY基因克隆和表达模式分析

范志毅 罗聪 余海霞 曾学梅 王金英 谢小杰 何新华

摘  要：FY是拟南芥自主途径中调控成花的基因，FY通过与RNA结合蛋白FLOWERING CONTROL LOCUS A （FCA）相互作用下调成花抑制基因FLOWERING LOUS C （FLC）的表达从而促进开花。目前关于FY基因如何调控芒果成花的机制尚无研究报道。通过挖掘芒果转录组数据克隆获得1个FY基因，命名为MiFY。生物信息学分析显示，MiFY基因的ORF全长为2178 bp，编码725个氨基酸，蛋白质分子量为799.59 kDa，理论等电点为8.72，氨基酸序列中含有WD40和Cytadhesin_P30两个保守结构域。基因表达模式分析显示，MiFY基因在2个芒果品种的开花期均具有较高的表达水平，而在营养生长期表达水平较低。因此推测MiFY基因可能在调节芒果成花中起着重要作用。

关键词：芒果;开花基因;FY;克隆;表达模式

Abstract： FY is a flowering gene in the autonomous pathway of Arabidopsis thaliana. The expression of the flower suppressor gene FLC is down regulated by interaction with the RNA binding protein FLOWERING CONTROL LOCUS （FCA）. The mechanism of how FY gene regulating the flower formation in mango has not been studied. In the study， a FY homologous gene was obtained from the transcriptome data of mango， named MiFY. Sequences analysis showed that the open reading frame of the gene had 2178 bp which encoding 725 amino acids. The molecular weight was 799.59 kDa and isoelectric point was 8.72， respectively. Conserved domain analysis showed that FY protein contained two conserved domains， WD40 and Cytadhesin_P30. Expression analysis showed that MiFY expressed in all tested tissues but with expression level differences. MiFY gene was higher expressed during the flowering development period and lower expressed during the vegetative growth period. The results indicated that MiFY gene may play an important role in regulating mango flowering.

Keywords： mango; flowering gene; FY; cloning; expression pattern

成花轉变是高等植物生长发育重要的生理过程之一。通过对模式植物拟南芥成花分子机制的研究发现，参与植物成花调控的途径包括光周期途径、春化途径、赤霉素途径、年龄依赖途径、温敏途径和自主途径[1]。在没有外源开花信号诱导的条件下，植物的营养生长达到一定阶段后也会开花的途径叫做自主途径[2]。其中，拟南芥的自主途径通过下调成花抑制基因FLOWERING LOUS C（FLC）的表达而促进开花[3]。目前自主途径至少包括7个基因：FY、FLOWERING CONTROL LOCUS A （FCA）、FLOWERING LOCUS D （FLD）、FLOWERING LOCUS K （FLK）、LUMINIDEPENDENS （LD）、FPA、FVE，任何一个基因的突变都会增加FLC的表达，导致开花延迟[4-5]。其中，FY基因作为一个高度保守的开花时间调控基因，是一个具有特殊C末端的真核蛋白聚腺苷酸化特异性因子（leavage and polyadenylation specificity factor，CPSF）复合物的亚单位，FY基因的C末端有2个植物独有的Pro-Pro-Leu-Pro-Pro（PPLPP）结构域，可与FCA-WW结构域相互作用形成复合体，FCA/FY复合体是RNA 3端的剪切因子，可调节FLC前体mRNA 3端剪切，抑制FLC基因的表达从而提早开花[6-8]，也可在缺少FCA的情况下自主抑制FLC基因的表达[9]。因此，FY基因对于植物的开花调控极其重要。目前已克隆出少数木本植物FY同源基因，但进一步的功能研究还较少。

芒果（Mangifera indica L.）为漆树科芒果属果树，是世界著名热带果树，其较长的童期是芒果新品种选育的最大障碍。目前在芒果成花研究中已有FLOWERING LOCUS T （FT）、CONSTANS （CO）、APETALA1 （AP1）等成花基因的相关研究[10-13]，但还没有关于FY基因的报道。本研究以广西地区一年能够多次成花多次结果（4～5次）的‘四季蜜芒和一年开花结果一次的‘台农一号芒为供试材料，克隆获得MiFY基因，对其序列进行生物信息学分析，同时通过实时荧光定量对其时空和组织表达进行分析，以明确MiFY基因的序列特征及在2个具有不同成花习性芒果品种正常花发育不同时期的表达模式，为深入研究FY基因在调控芒果成花过程中的功能奠定基础。

1  材料与方法

1.1  材料

供试材料为16年生‘四季蜜芒和‘台农一号芒，种植于广西大学农学院果树标本园。组织表达特性和年周期样品采集分别为2018年11月5日、12月5日，以及2019年1月4日和29日、3月6日的‘四季蜜芒和‘台农一号芒的成熟叶、成熟茎和芽/花。采样时间统一定为17：00—18：00，样品采集后立即放入?80 ℃冰箱冷冻保存。

1.2  方法

1.2.1  RNA的提取及cDNA的合成  采用天根生化科技（北京）有限公司的RNAperp Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取芒果RNA，方法参考试剂盒说明书。逆转录采用TaKaRa公司的Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）反转录酶合成第一链cDNA，用双蒸水稀释cDNA浓度至100 ng/μL，保存于?40 ℃备用。

1.2.2  MiFY基因的克隆与序列信息分析  以反转录得到的cDNA为模板，根据前期芒果转录组测序获得的MiFY基因序列设计特异引物。其中正向引物为MiFYu（5-ATGATGT ACGC TGA T CCTCA-3），反向引物为MiFYd（5-CCTACTGC GGCGTTTGGCTA-3）。PCR体系为25 μL，扩增程序为：95 ℃预变性3 min;95 ℃变性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸150 s，36个循环;最后在72 ℃下延伸10 min。用1.6%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将目标片段利用胶回收试剂盒进行纯化，并连接至pMD18-T载体上，然后转化大肠杆菌DH5α感受态。涂板后挑选单菌落进行菌落PCR检测，经筛选的阳性克隆被送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。为了预测MiFY蛋白的生物学功能，在NCBI数据库的Conserved Domain Search中搜索MiFY蛋白同源序列。利用DNAMAN 8.0软件进行同源氨基酸序列比对，然后用邻接法（Neighbour-Joining， N-J）进行聚类分析并构建系统发育树。

1.2.3  MiFY基因时空和组织特异性表达分析  根据MiFY基因序列设计荧光定量PCR引物。正向引物为qMiFYu（5-CATCAGCAGAATCAG CCGCAG-3），反向引物为qMiFYd（5-GA G TAGTGGACGAGGCAGACG-3）。以芒果Actin1为内参基因[14]，引物为qActinu（5-CCGAGACAT GAAGGAGAAGC-3），qActind（5-GTGG TC TCATGGATACGAGCA-3）。实时荧光定量PCR仪器为ABI7500。扩增反应体系和程序参照试剂盒SYBR Premix Dimer Eraser（TaKaRa）说明书进行。以50 ng/?L的cDNA为模板，反应总体系为20 ?L，其中cDNA 1.5 ?L，上下游引物各0.5 ?L，SYBRⅡ 10 ?L，ROXⅡ 0.4 ?L，超纯水7.1 ?L。PCR程序为：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环;95 ℃ 15 s。采用2?ΔΔCT法计算相对表达水平[15]。

2  结果与分析

2.1  MiFY基因的克隆

在前期转录组研究中，获得了1个FY基因的全长。为了验证FY基因序列的正确性，设计了能够扩增基因全长编码区的特异引物，以逆转录产物cDNA为模板，通过RT-PCR法克隆‘四季蜜芒MiFY基因，电泳检测显示成功获得1条长度约为2200 bp的条带，与目的条带大小一致（图1）。将克隆结果送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，获得的序列长度为2178 bp，与转录组获得的序列一致。

2.2  MiFY基因生物信息学分析

利用IBS 1.0软件描述MiFY蛋白结构域，结果表明，MiFY由7个连续重复的WD40和2个PPLPP结构域组成（图2）。利用DNAMAN 8.0将MiFY与柑橘、橡胶树等其他植物的氨基酸序列进行比对，其中，单下划线为WD40结构域，双下划线为PPLPP结构域（图3）。为了分析MiFY的亲缘关系，使用DNAMAN 8.0的N-J方法进行聚类分析，并构建系统发育树（图4）。结果显示，芒果MiFY与柑橘CsFY1同源性最高，氨基酸相似性为86.48%，在进化上和柑橘（CsFY）、蓖麻（RcFY）较为接近，同源性分别为86.07%、84.17%。由此可确定克隆所得基因为芒果FY同源基因MiFY，GenBank登录号为MT199952。

2.3  MiFY基因表达模式分析

為了探讨MiFY基因在不同组织和不同成花时期的表达模式，在芒果成花不同发育时期，分别采集茎、叶和芽/花为材料进行荧光定量检测（图5），结果表明，在‘四季蜜芒中，FY基因在各个测试组织的各个时期均表达，但在芒果的成花诱导期之前表达水平偏低，而诱导期之后表达水平迅速上升，其中在成熟叶和芽中的上升水平高于成熟茎中的表达。MiFY基因的最高表达高峰出现在开花期的成熟叶中，其次是在花芽分化期的顶芽中。在‘台农一号芒中，MiFY基因模式与在‘四季蜜芒中的表达情况类似，均在成花诱导期之前表达水平很低，但其表达高峰主要出现在花芽分化后期和成花期，MiFY基因的最高表达高峰出现在花芽分化期的顶芽中，其次是在花芽分化期的成熟茎中，而在开花期的花中也有很高的表达水平。在2个不同的品种中，MiFY基因的整体表达趋势类似，但又存在着组织表达差异。

3  讨论

近年来，借助拟南芥突变体，影响植物成花的很多基因被挖掘出来，植物成花调控网络的研究也越来越深入。与模式植物拟南芥相比，木本果树具有较长的童期，严重影响果树的育种进程，因此对果树成花基因的挖掘与功能研究对缩短木本果树的童期具有重要意义。FY基因作为自主途径中调控植物成花的重要基因，其具有多重功能。据报道，FY基因的主要功能是正确定位成花抑制基因FLC的多腺苷化而控制开花时间[9]。FY作为FLC的激活剂和抑制剂在调控开花时间中具有双重作用，可与FCA相互作用抑制FLC活性，也可通过激活FLC的表达而延迟开花[16]。此外，FY在种子休眠、ABA响应、胚胎发育等过程中发挥作用[17-18]。最新研究结果表明，FY在mRNA多腺苷化中具有保守性和特異性功能[19]。因此，研究和阐明FY基因在开花途径中的调控机理，对探索木本植物花期调控具有重要意义。

目前，FY基因的功能研究仅在少数单子叶植物（水稻、黑麦草、蝴蝶兰）和双子叶植物（拟单南芥）中[20-21， 23]，在木本植物中的调控机制尚未见系统报道。鉴于此，本研究在前期已完成芒果转录组测序的基础上，成功获得1个FY同源基因，采用RT-PCR技术从‘四季蜜芒中克隆得到了MiFY的编码区序列，对其氨基酸序列特性和蛋白结构进行分析，并分析MiFY在2个芒果品种中的表达模式。结果显示，MiFY包含7个WD重复区域和2个PPLPP保守结构域，与前人报道相同[20， 22]。其中，第一个PPLPP保守结构域在C端区高度保守，与前人研究结果一致[7]。系统发育树显示，芒果的MiFY与柑橘进化关系最近，它们都属于木本植物，这符合植物各科属在进化中的关系。黄玉婷[23]研究发现FY基因在蝴蝶兰各个发育时期均表达，其中在第84天表达量最高，之后持续缓慢降低。本研究中MiFY基因在2个不同开花习性芒果品种的所有测试组织中均表达，但存在组织表达差异，并且发现MiFY基因在2个芒果品种成花期均大量表达，而在营养生长期表达水平较低，这与在蝴蝶兰中的结果类似。因此可以推测MiFY基因在不同芒果品种的成花过程均发挥重要作用。

本研究通过对芒果MiFY基因的克隆、序列分析和基因表达模式分析，为进一步深入研究MiFY基因的功能奠定基础。

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责任编辑：黄东杰