稀释液中添加维生素C对湖羊精液低温保存效果的影响

郭良勇，殷雨洋，周俊波，曹访*，王翀，郑开之，吴建良，彭彩娥

(1. 湖州市农业科学研究院湖羊研究所，浙江 湖州 313000；2. 湖州师范学院生命科学学院，浙江 湖州 313000；3. 浙江农林大学动物科技学院，浙江 临安 311300；4. 浙江省农业科学院畜牧兽医所，浙江 杭州 310021；5. 湖州市动物疫病预防控制中心，浙江 湖州 313000)

近年来，随着人工授精技术在家畜繁殖领域的逐步推广，依托稀释液的精液液态低温保存技术也逐渐受到研究者的关注。液态低温保存是通过温度降低使精子代谢减弱，从而延长精子存活时间，当温度回升后，能够恢复正常代谢机能而不丧失受精能力。稀释液配方是液态低温保存的关键环节之一，良好的稀释液包含营养物质、抗氧化剂、酶和激素等各种成分，不仅可以扩大有效精液容积，还可以为精子代谢提供所需的能量物质[1-2]，可提高精子活力、延长精子寿命。

目前，在精液稀释保存领域针对抗氧化物的添加效果研究，越来越受到科研工作者的关注。维生素不仅是一种酸性抗氧化剂，也是一种重要的和有效的自由基清除剂[3]，它能有效地维持精细胞基因的完整，保护精子质膜免受氧化，因此在畜禽精液的保存过程中发挥重要作用[4]。Aurich等[5]向马的精液中添加0.9 mg/mL维生素C，发现维生素C能抑制精子代谢，从而延长精子的存活时间。马红等[6]向含有民猪精液的常温稀释液中添加维生素C，发现可提高精子活力和质膜完整率，延长精液保存时间。此外还有研究表明，维生素C可提高藏猪、贵州黑山羊、藏西北绒山羊、马等家畜精液的4 ℃液态保存的效果[7-10]。鉴于此，本试验在精液稀释保存液中添加不同水平的维生素C，探究其对湖羊精子体外生存状况的影响，以期为精液稀释保存液的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

健康、繁殖能力正常且年龄在2～3周岁的成年种公羊5头，湖州市农业科学研究院湖羊试验场提供。

1.2 药品及试剂

维生素C、果糖、三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸均为分析纯级别。精子快速染色试剂盒、总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒、丙二醛(MDA)检测试剂盒、过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 精液采集

利用假阴道法采集精液，精液采集后放入预温的集精杯中并于30 min内带回实验室，用显微镜于37 ℃水浴进行精液品质检测，鲜精活力达到0.85以上的用于试验。

1.4 稀释与保存

试验采用前期筛选的湖羊精液稀释液配方，配方为：果糖5 g/L、三羟甲基氨基甲烷30.63 g/L、柠檬酸19.9 g/L，蛋黄添加浓度20 %[11]。试验分3组，以不添加维生素C的基础稀释液为对照组，以添加1 mg/mL、3 mg/mL维生素C的稀释液为试验1组、试验2组。在等温条件下按1∶3的稀释倍数对原精进行稀释，将稀释后的精液保存在4 ℃冰箱中。在精液保存过程中，每12 h翻动1次精液。保存0、24、48、72、96 h后，检测精子活力、T-AOC、MDA、GSH-Px、CAT，试验重复3次。

1.5 精液品质检测

1.5.1 精子常规指标

在显微镜下观察精子活力，采用百分制法，计算直线前进精子数占总精子数的百分比。

1.5.2 精子生化指标

使用相应试剂盒，对精液的精浆中T-AOC、MDA、GSH-Px、CAT进行测定。其中T-AOC检测依据Fe3+还原比色法原理，比色波长为520 nm；MDA检测依据硫代巴比妥酸比色法原理，比色波长为532 nm；GSH-Px采用二硫代二硝基甲酸比色法原理，比色波长为412 nm；CAT检测依据钼酸铵比色法原理，比色波长为405 nm。以上测定相关操作均严格按照南京建成生物工作有限公司试剂盒说明书要求进行。

1.6 数据统计与分析

试验数据用Excel软件进行处理，SPSS 23.0进行双因素方差分析；结果以“平均值±标准差”表示，P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 维生素C对湖羊精液4 ℃保存时精子活力的影响

由表1可知，随着保存时间的延长，对照组、试验1组和试验2组的精子活力整体呈显著下降趋势，各组96 h精子活力最低；24、48、72、96 h与0 h相比下降极显著(P<0.01)。试验2组的精子活力下降最快，24 h活力低于0.1，且24、48、72、96 h活力均极显著低于对照组和试验1组(P<0.01)。对照组和试验1组的活力保持较好，96 h活力都在0.7以上，但试验1组的24、48、72、96 h活力极显著高于对照组(P<0.01)。

表1 湖羊精液4 ℃保存时的精子活力变化

2.2 维生素C对湖羊精液4 ℃保存时精浆中MDA含量的影响

由表2可知，时间和维生素C对精浆中MDA含量影响极显著(P<0.01)。随着保存时间的延长，对照组、试验1组、试验2组的精浆中MDA含量整体呈曲折下降的趋势。试验1组和试验2组0、24、48、72、96 h精浆中MDA含量极显著低于对照组(P<0.01)；试验2组0、24、48 h精浆中MDA含量极显著低于试验1组(P<0.01)，96 h时试验2组显著低于试验1组(P<0.05)，但72 h时两组差异不显著(P>0.05)。

表2 湖羊精液4 ℃保存时精浆中MDA含量变化 nmol/mL

2.3 维生素C对湖羊精液4 ℃保存时精浆中T-AOC水平的影响

由表3可知，时间和维生素C对精浆中T-AOC水平影响明显。与对照组相比，添加维生素C的试验1组和试验2组精浆中T-AOC水平成倍数增长，保存0、24、48、72、96 h，其T-AOC水平极显著高于对照组(P<0.01)，且试验2组精浆中T-AOC整体水平极显著高于试验1组(P<0.01)；随着保存时间延长，T-AOC水平逐渐降(P<0.01)。

表3 湖羊精液4 ℃保存时精浆中T-AOC水平变化 U/mL

2.4 维生素C对湖羊精液4 ℃保存时精浆中GSH-Px活力的影响

由表4可知，时间和维生素C极显著影响精浆中GSH-Px活力(P<0.01)。随着保存时间的延长，对照组、试验1组和试验2组精浆中GSH-Px活力整体呈极显著下降趋势(P<0.01)。虽然试验1组0 h精浆中GSH-Px活力极显著低于对照组(P<0.01)，但24、48、72、96 h精浆中GSH-Px活力极显著高于对照组(P<0.01)；试验2组精浆中GSH-Px活力整体极显著低于试验1组(P<0.01)。

表4 湖羊精液4 ℃保存时精浆中GSH-Px活力变化 U/mL

2.5 维生素C对湖羊精液4 ℃保存时精浆中CAT活力的影响

由表5可知，时间和维生素C极显著影响精浆中CAT活力。试验1组在0、24 h，精浆中CAT活力极显著低于对照组(P<0.01)，但在48、72、96 h精浆中CAT活力极显著高于对照组(P<0.01)。试验2组精浆中CAT水平整体显著低于试验1组。

表5 湖羊精液4 ℃保存时精浆中CAT活力变化 U/mL

3 讨论

3.1 保存时间对湖羊精子活力的影响

在绵羊精液液态低温保存过程中，稀释液中营养成分充分保障精子代谢的营养需求，低温条件下精子的运动和代谢速率下降慢，精子体外存活时间得以延长，同时不丧失受精能力。但在精液的稀释处理、降温以及低温保存过程中，都会不可避免产生大量活性氧(ROS)和活性氮(RNS)，它们会对精子结构和遗传物质稳定性造成不可逆损伤。虽然适量ROS对维持精子正常的生理功能是必要的，如生理功能的调节、结合透明带能力的提升等[12]，但过量ROS会造成精子DNA碎裂、质膜损伤、线粒体功能异常和凋亡等，最终缩短精子在体外存活时间[13]。研究表明，绵羊精液保存过程中ROS主要由精子的芳香族氨基酸氧化酶催化产生，这种酶主要来源于死精子。如果精液中死精子越多，芳香族氨基酸氧化酶活性越强，从而造成恶性循环，导致某些仍有活力的精子因为ROS浓度升高而受到损害[14]。本试验中，对照组、试验1组和试验2组精子活力整体都呈极显著下降趋势，这可能与精液采集、稀释、降温处理等过程导致部分精子死亡，释放出过量芳香族氨基酸氧化酶，产生过量ROS等物质有关。过量的ROS不利于精子的存活，随着保存时间的延长，死亡精子显著增加，从而引发恶性循环，进而导致精子活力极显著降低。

3.2 维生素C对湖羊精子活力的影响

维生素C是哺乳类动物精液稀释保存中添加的常用维生素类抗氧化剂。本研究发现，添加维生素C的试验组0 h精子活力要略低于对照组，且添加浓度更高的试验2组精子活力更低，这可能与添加了维生素C的稀释液渗透压偏高有关。赵宪林等[15]研究发现，一定浓度的维生素C对荷斯坦牛X精子活力具有显著提高作用，而高浓度则对精子存活不利，原因是高浓度维生素C可能导致稀释液浓度较大，渗透压较高。本研究也证实，当维生素C添加浓度达到3 mg/mL时，湖羊精子活力显著降低，这可能是因为维生素C添加浓度过高会导致稀释液渗透压偏高，精子无法正常代谢，进而影响精子细胞结构的稳定性，导致精子活力偏低。

试验中添加1 mg/mL维生素C的试验1组，虽然0 h精子活力由于稀释液渗透压存在差异的原因略低于对照组，但24、48、72、96 h后的精子活力要极显著高于对照组，说明1 mg/mL的维生素C可以延缓湖羊精子活力的下降趋势，延长精液的保存时间。这可能与维生素C是一种有效的自由基清除剂有关[3]。由于湖羊精液在稀释和保存过程中，产生的大量ROS会攻击精细胞质膜上丰富的多不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化反应，从而导致精子质膜过氧化损伤。Valcarce等[16]研究发现，ROS的产生会诱导浆细胞构象和完整性发生不可逆损伤，造成DNA损伤并加速细胞凋亡。正常情况下湖羊原精中含有大量抗氧化物质，可以发挥自身抗氧化系统作用而消除大部分自由基。但由于稀释过程中导致抗氧化物浓度大大降低，因而会对精液保存效果造成一定影响[17]。而维生素C作为一种外源性抗氧化剂，可在一定程度上增强精液稀释后系统内部的抗氧化能力，及时清理代谢产生的ROS，减轻对精子质膜的过氧化损伤，减少DNA损伤并减缓精细胞凋亡，从而达到保护顶体、提高精子活力的效果。此外，研究表明合理浓度的维生素C，其偏酸性可抑制羊精液低温保存时精子代谢，延长精子存活时间[18]。本试验也证实，添加1 mg/mL的维生素C，可提高湖羊精液的保存质量，提高精子活力。

本试验中，1 mg/mL的维生素C添加浓度是精液4倍稀释后的浓度，相当于原精液中的维生素C添加量为4 mg/mL，陈宗明等[7]、宋天增等[19]在原精液中分别添加3 mg/mL、2 mg/mL维生素C可显著提高云贵高原贵州黑山羊、藏西北绒山羊精液4 ℃保存的精子活力与本试验结果基本一致。维生素C的添加量差异可能与羊的品种以及本试验的浓度设计有关，具体原因还有待进一步研究。

3.3 维生素C对精浆中MDA含量、T-AOC水平、GSH-Px和CAT活力的影响

哺乳动物精液自身具有抗氧化系统，主要由超氧化物歧化酶(SOD)、CAT、GSH-Px和谷胱甘肽还原酶(GR)等组成[20-21]，它们可以清除ROS，防止过氧化反应的发生。在精子细胞内，SOD催化超氧阴离子自由基(O2-)为过氧化氢(H2O2)，后者将其呈递给CAT和GSH-Px。在二者的共同作用下降解为水和氧气，可降低超氧阴离子自由基(O2-)对细胞膜的损害[22]。王争光等[23]在金华猪精液的冷冻稀释液中添加一定浓度的抗氧化剂SOD，发现可显著提高猪精子4 ℃平衡后的活率、解冻后精子活率和质膜完整率。易康乐等[24]在水牛冷冻保存液中添加一定浓度的SOD和GSH，发现可以显著提高精子冷冻解冻后活率，且两者共同加入时效果更明显。任俊玲等[25]在冷冻稀释液中联合添加一定浓度的SOD和CAT，可明显提高冷冻精液解冻后的精子活力、活率、质膜完整率和顶体完整率。相关研究表明，GSH-Px、T-AOC和CAT 可以反映出精液内部抗氧化系统清除ROS，减少过氧化反应，进而延长精子的存活时间的能力。本试验添加1 mg/mL维生素C的试验1组，其精浆中的GSH-Px和CAT活力相对于对照组显著降低，但后期活力都要极显著高于对照组，说明维生素C具有延缓GSH-Px和CAT活力丧失的功能。且添加维生素C的试验1组和试验2组T-AOC水平要极显著高于对照组，96 h内都维持在一个较高水平，说明维生素C能显著增强精液自身内部的抗氧化功能。

由于ROS攻击精细胞膜引发脂质过氧化反应，会产生MDA等脂质过氧化物，而MDA主要通过影响线粒体内酶的活性，引起蛋白质和核酸等生物大分子聚合，对细胞产生毒害作用[26]，因此MDA的水平在一定程度上反映了精细胞膜脂质过氧化损伤情况[27]。本研究中，添加维生素C可以显著降低精液中的MDA含量，说明外源性维生素C，在一定程度上可以抑制过氧化反应，减少MDA的产生量，从而减轻对精细胞的毒害作用，进而延长精子的有效保存时间。

本研究证实，合理浓度的维生素C一方面通过增加系统抗氧化物浓度，提高相关抗氧化酶活力，激活精液自身抗氧化系统，及时清理ROS；另一方面通过弱酸性抑制精子代谢，减少ROS的产生，从而减轻对精细胞膜和遗传物质的损伤，达到提高精子活力，提高精液保存质量的效果。

4 结论

研究结果表明，在湖羊精液4 ℃保存稀释液中，添加1 mg/mL浓度的维生素C，可显著提高精子活力，延缓GSH-Px、CAT活性下降，提高T-AOC水平，减少MDA生成量，从而提高精液保存效果。本研究结果将为湖羊精液低温保存的生产应用奠定基础。