青钱柳黄酮对幼年免疫低下并肥胖大鼠血糖、血脂、免疫功能的调节作用▲

刘 庆 宋建刚 卢 蓉 李元霞

(延安大学附属医院儿科一病区，陕西省延安市 716000，电子邮箱：happymuzi66@163.com)

7～10岁年龄段是儿童肥胖的高风险时期，食用油的高消耗以及高脂肉类膳食是儿童肥胖的高风险因素[1-3]。研究表明，高脂肪饮食会增加各种组织的氧化应激，这可能会导致许多退化性疾病发生[4-5]，而补充抗氧化剂可以预防许多高脂肪饮食引起的疾病[6]。青钱柳具有抗氧化、降血压、抗糖尿病等多种生物活性[7]，例如青钱柳的提取物及其多种衍生物可能具有调节机体免疫力的功效[8-9]，青钱柳黄酮可降低大鼠血脂、血糖，并具有免疫调节的作用[10-11]。然而，青钱柳黄酮对儿童是否同样具有以上作用仍不明确。本研究探讨不同浓度的青钱柳黄酮对高脂合并低免疫力的幼年大鼠的血脂、葡萄糖、免疫平衡的调节作用。

1 材料与方法

1.1 试剂 青钱柳黄酮(含量:16.2%)购自湖南和然生物科技开发有限公司(批号：574-12-9)。环磷酰胺购自西安晨星植物科学技术有限公司(批号：180113-14)；总胆固醇检测试剂盒(批号：MAK043)、三酰甘油检测试剂盒(批号：TR0100)、LDL-C检测试剂盒(批号：MAK045)和HDL-C检测试剂盒(批号：MAK045)购自美国Sigma Diagnostics公司；血液葡萄糖检测试剂盒(批号：00001869)购于DiaSys Diagnostic Systems GmbH；细胞裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司(批号：C3702)；RPMI 1640完全培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司(批号：PM150110B)；四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)购自上海碧云天生物技术有限公司(批号：C0009S)；兔抗鼠磷酸化核因子κB(phosphorylated nuclear factor κB,p-NF-κB) p65抗体(批号：ab76302)购于美国Abcam公司；戊巴比妥钠(批号：57-33-0)购于美国Sigma公司；刀豆凝素(批号：11028-71-0)和二甲基亚砜(批号：67-68-5)均购于美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 实验动物及分组 2周龄的SD雄性大鼠60只，购于空军军医大学实验动物中心[SCXK(陕)2019-001]。大鼠在22℃的恒定室温下饲养于12 h/12 h亮/暗周期环境中。采用随机数字表法将大鼠分为6组，每组各10只，包括对照组、高脂组、环磷酰胺+高脂组、治疗组Ⅰ、治疗组Ⅱ、治疗组Ⅲ。

1.3 干预方法及标本获取 实验前记录所有大鼠的体重(初体重)。治疗组Ⅰ、治疗组Ⅱ、治疗组Ⅲ的干预方法：大鼠均自由饮水，并给予高脂饮食，环磷酰胺50 mg/kg灌胃(1次/d)，在此基础上治疗组Ⅰ、治疗组Ⅱ、治疗组Ⅲ分别给予大鼠20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg的青钱柳黄酮灌胃(1次/d)。环磷酰胺+高脂组的干预方法：除将青钱柳黄酮灌胃替换为同体积的生理盐水灌胃外，其余干预方法与治疗组相同。高脂组：除将环磷酰胺灌胃替换为同体积的生理盐水灌胃外，其余干预方法与环磷酰胺+高脂组相同。对照组：只给予相同体积的生理盐水灌胃，且饮食为基础饮食。均连续干预15 d，每周记录体重。干预结束后，称量所有大鼠的体重(终体重)，并在剥夺食物12 h后次日的09：30至10：00之间，腹腔注射1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉后，从尾静脉收集血液1.0 mL到采血管中。在4℃下以1 500 r/min的速度离心15 min以获取血浆，并在-80℃下保存用于后续实验。采血后立即将大鼠处死，然后取出肝脏、脾脏、胸腺，称重后在80℃下保存。

1.4 生化指标检测 剥夺食物12 h后于次日的9:30至10:00采血检测。M179289动物生化分析仪购自北京中西华大科技有限公司。采用酶和比色法检测总胆固醇、三酰甘油、LDL-C、HDL-C水平，使用酶促反应方法检测血糖。

1.5 脏器指数评测 取胸腺、肝脏和脾脏，用预冷生理盐水漂洗，滤纸吸干水分，称重计算脏器指数。胸腺指数(mg/g)=胸腺质量(mg)/体质量(g)，脾脏指数(mg/g)=脾脏质量(mg)/体质量(g)，肝脏指数(mg/g)=肝脏质量(mg)/体质量(g)。

1.6 脾淋巴细胞增殖情况的测定 在超净工作台内，将大鼠脾脏压碎后加入红细胞裂解液进行裂解，2 min后加入RPMI 1640完全培养基终止裂解，200目筛网过滤，收集滤液后于4℃下1 000 r/min离心5 min，用RPMI 1640完全培养基重悬以制备脾淋巴细胞悬液，调整细胞浓度至1×107个/mL。将脾淋巴细胞悬液按100 μL/孔的浓度加入96孔板中，用移液枪在实验孔加入100 μL的刀豆凝集素(终浓度为5 μg/mL)，对照孔加入100 μL RPMI 1640完全培养基，均设3个复孔，置于37℃、5% CO2孵箱中培养16 h后加20 μL浓度为5 mg/mL的MTT，继续培养4 h后弃上清,加入150 μL 二甲基亚砜,37℃振荡10 min，使用ELX800酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)在490 nm处测定吸光值。计算细胞增殖率，细胞增殖率(%)=(实验孔吸光值-对照孔吸光值)/对照孔吸光值×100%。

1.7 免疫组织化学法检测脂肪组织p-NF-κBp65的表达 分离6组大鼠腹腔的白色脂肪，置于10%中性福尔马林液中固定后进行常规石蜡包埋。蜡块切片后进行脱蜡及抗原修复，按试剂盒说明书逐步进行免疫组化染色。采用DEIAS-2000丹尼尔医学图像分析系统进行图像分析。由不同的5名病理学专家，在200倍光镜下，随机取5个视野，用Image J软件测定阳性染色区(视野区域出现的黄色、棕黄色、棕褐色为阳性区，5名病理学专家的意见需统一)的光密度值。计算5个视野的均值。

2 结 果

2.1 6组大鼠体重的比较 6组大鼠的初体重差异无统计学意义(P>0.05)。高脂组、环磷酰胺+高脂组、治疗组Ⅰ、治疗组Ⅱ、治疗组Ⅲ大鼠的终体重均高于对照组(P<0.05)，提示成功建立肥胖大鼠模型；而高脂组、环磷酰胺+高脂组、治疗组之间两两对比，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 6组大鼠干预前后的体重比较(±s,g)

2.2 6组大鼠血脂水平的比较 高脂组、环磷酰胺+高脂组、3个治疗组血清总胆固醇、三酰甘油、LDL-C水平均高于对照组，而高脂组、环磷酰胺+高脂组、治疗组Ⅰ、治疗组Ⅱ的血清HDL-C水平低于对照组(均P<0.05)，但环磷酰胺+高脂组与高脂组的血脂水平差异均无统计学意义(均P>0.05)。环磷酰胺+高脂组、治疗组Ⅰ、治疗组Ⅱ、治疗组Ⅲ的血清总胆固醇、三酰甘油、LDL-C水平依次降低(均P<0.05)；3个治疗组的血清HDL-C水平均高于环磷酰胺+高脂组(均P<0.05)，治疗组Ⅱ、治疗组Ⅲ的血清HDL-C水平差异无统计学意义(P>0.05)，但均高于治疗组Ⅰ(均P<0.05)。见表2。

表2 6组大鼠血脂水平的比较(±s,mmol/L)

2.3 6组大鼠血糖和肝脏指数的比较 高脂组、环磷酰胺+高脂组的血糖水平和肝脏指数均高于对照组(均P<0.05)，但环磷酰胺+高脂组与高脂组的血糖水平和肝脏指数差异无统计学意义(均P>0.05)。治疗组Ⅰ、治疗组Ⅱ、治疗组Ⅲ的血糖水平以及治疗组Ⅰ、治疗组Ⅱ的肝脏指数均高于对照组(均P<0.05);环磷酰胺+高脂组、治疗组Ⅰ、治疗组Ⅱ、治疗组Ⅲ的血糖水平和肝脏指数依次降低(均P<0.05)。见表3。

表3 6组大鼠血糖水平和肝脏指数的比较(±s)

2.4 6组大鼠免疫脏器指数和脾淋巴细胞增殖率的比较 高脂组、对照组、环磷酰胺+高脂组大鼠的脾淋巴细胞增殖率、胸腺指数及脾脏指数依次降低(均P<0.05)。治疗组Ⅰ、治疗组Ⅱ、治疗组Ⅲ的脾淋巴细胞增殖率和胸腺指数及脾脏指数均低于对照组，但高于环磷酰胺+高脂组(均P<0.05)，且治疗组Ⅰ、治疗组Ⅱ、治疗组Ⅲ的脾淋巴细胞增殖率、胸腺指数、脾脏指数均依次升高(均P<0.05)。见表4。

表4 6组大鼠免疫脏器指数和脾淋巴细胞增殖率的比较(±s)

2.5 6组大鼠脂肪组织中p-NF-κB p65表达水平的比较 对照组中的p-NF-κB p65主要在细胞质中表达，而高脂组和环磷酰胺+高脂组亦可见p-NF-κB p65在细胞核中表达，见图1。高脂组、环磷酰胺+高脂组大鼠脂肪组织内p-NF-κB p65表达水平均高于对照组(均P<0.05)，但高脂组、环磷酰胺+高脂组及治疗组Ⅰ差异无统计学意义(P>0.05)。与环磷酰胺+高脂组比较，治疗组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的p-NF-κB p65的表达均下调(均P<0.05)。3个治疗组的p-NF-κB p65表达水平差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表5。

图1 大鼠脂肪组织p-NF-κB p65免疫组化染色结果(200×)

表5 6组大鼠脂肪组织p-NF-κB p65表达水平的比较(±s)

3 讨 论

高脂饮食能够加速幼年和青年阶段啮齿动物体重的增加[12]。本研究结果也显示，在2周龄到4周龄阶段，经高脂喂养后的SD大鼠体重明显高于正常喂养的对照组大鼠，验证了接触高脂饮食会加速体重增加，但环磷酰胺和青钱柳黄酮对大鼠的体重影响不明显。已有研究表明环磷酰胺是低免疫动物模型的诱导药物[13]，因此我们利用环磷酰胺干预肥胖大鼠，结果显示环磷酰胺+高脂组和3个治疗组肥胖大鼠的脾淋巴细胞增殖率、胸腺指数及脾脏指数均下调(均P<0.05)，提示成功利用环磷酰胺诱导幼年肥胖大鼠的低免疫状态。然而，高脂组大鼠的脾淋巴细胞增殖率、胸腺指数及脾脏指数均高于对照组大鼠，提示高脂可引起与环磷酰胺相反的免疫反应。

总胆固醇、三酰甘油、LDL-C、HDL-C是诊断和评估心血管疾病的关键指标，尤其是冠状动脉疾病。本研究中，几乎在所有高脂饮食大鼠中均可观察到异常的血脂水平，提示高脂饮食可以升高血脂水平，与既往的研究结果[14]相似，这也表明高脂饮食亦是幼年大鼠血脂异常的关键诱因[15]。此外，长期高脂饮食可以增加动物的血糖水平[16]，我们也发现幼年大鼠经高脂饮食喂养后发生高血糖现象。本研究结果还显示，高脂组和环磷酰胺+高脂组的大鼠均存在血糖和血脂异常，但两组的血糖、血脂及肝脏指数差异并无统计学意义(P>0.05)，表明高脂饮食对血糖、血脂和肝脏代谢发挥关键作用。而已有多项研究表明，青钱柳提取物具有促进脂肪代谢、降血脂的作用，可抑制肥胖大鼠血清中总胆固醇的升高[10,17-18]。还有研究证实，青钱柳黄酮是α-葡萄糖苷酶的抑制剂，其与该酶迅速结合[19]。另外，含有青钱柳黄酮的青钱柳叶能降低2型糖尿病大鼠的血糖和血脂[20]。本研究结果显示，环磷酰胺+高脂组、治疗组Ⅰ、治疗组Ⅱ、治疗组Ⅲ的血糖以及血清总胆固醇、三酰甘油、LDL-C水平依次降低(均P<0.05)，提示青钱柳黄酮对幼年肥胖低免疫力大鼠具有降血脂、降血糖的作用，并呈一定的剂量依赖性。

研究表明，青钱柳可以保护机体免受自由基伤害，且不良反应较少[21]；此外，青钱柳提取物对环磷酰胺导致的免疫低下小鼠的免疫功能具有明显的改善和调节作用[22]。然而青钱柳黄酮对免疫紊乱的肥胖幼年动物免疫功能改善作用的研究较少。本研究结果显示，治疗组Ⅰ、治疗组Ⅱ、治疗组Ⅲ的脾淋巴细胞增殖率和胸腺指数及脾脏指数均高于环磷酰胺+高脂组，且依次升高(均P<0.05)，这表明青钱柳黄酮可以减轻环磷酰胺对肥胖幼年大鼠的免疫抑制作用，且具有一定的剂量依赖性。高血糖、高血脂等因素可激活核因子(nuclear factor κB,NF-κB)信号通路，并进一步激活脂肪合成等病理变化[23]，因此调节NF-κB的激活是干预和治疗肥胖的有效措施[24]。当细胞处于静息状态时，NF-κB位于细胞质中，其p65亚基与NF-κB抑制蛋白单体结合，覆盖p50蛋白的核定位信号，抑制NF-κB的核转位，被激活的NF-κB则进入细胞核调节基因转录[25]。已有研究表明，在2型糖尿病大鼠中，青钱柳叶可以抑制NF-κB的激活并发挥抗炎作用[26]。在本研究中，免疫组化检测结果显示，高脂组、环磷酰胺+高脂组及治疗组Ⅰ的脂肪组织中p-NF-κB p65都出现核易位，3组的p-NF-κB p65的表达水平均高于正常大鼠，但高脂组和环磷酰胺+高脂组比较无明显差异。而与环磷酰胺+高脂组比较，3个治疗组的p-NF-κB p65表达水平均下调，提示青钱柳黄酮可能通过抑制NF-κB信号激活干扰脂肪合成，进而影响肥胖的发展和免疫炎症。

综上所述，高脂饮食联合环磷酰胺可引起幼年大鼠出现高血糖、血脂、免疫力低下；而青钱柳黄酮可剂量依赖性地改善幼年低免疫力肥胖大鼠的血糖、高血脂、免疫异常，并抑制脂肪组织中NF-κB信号的激活。

(致谢：感谢延安大学基础医学院王杰老师在动物实验上给予的帮助和支持。)