基于HPLC指纹图谱和多指标定量的黄芩趁鲜加工研究

张雪梅，张刘伟，何凯乐，刘景玲，许宏亮，梁宗锁,4*

1.西北农林科技大学化学与药学院，陕西 杨凌 712100

2.西北农林科技大学生命科学学院，陕西 杨凌 712100

3.天津天士力现代中药资源有限公司，天津 300400

4.浙江理工大学生命科学与医药学院，浙江 杭州 310018

黄芩是唇形科黄芩属植物黄芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根，是我国常用的大宗药材之一，具有泻火解毒、清热燥湿、止血安胎等功效[1]。黄芩含有多种化学成分，近年来，已从黄芩中发现了多种化学成分，包括黄酮类、酚酸类、苯乙醇、氨基酸、甾醇、精油、微量元素等[2]。黄酮类是黄芩的主要有效成分，包括黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A 等，具有抗炎、抗肿瘤、抗菌、降血压等多种现代药理活性[3-6]。其中黄芩苷（黄芩素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷）是黄芩中黄酮类成分的代表，是评价黄芩药材质量的主要依据[7-9]。近年来，由于人工采挖较为频繁，黄芩资源短缺，人工种植黄芩也越来越多，栽培黄芩已成为黄芩药材的主要来源[10-11]。

中药材采收后，除鲜用外，一般都必须进行初步处理与干燥。中药材产地干燥初加工是中药材初加工或产地加工过程中不可缺少的环节[12]。采收后，含水量较高，若不及时加工处理，很容易霉烂变质，严重影响药材质量、临床疗效以及药农的经济效益。而趁鲜加工作为新型加工方法，打破了传统加工的限制，不仅节省工时，保障药材质量，而且运输方便，节约成本，已成为药材加工的主流方向。目前，已有多种药材可进行产地加工[13-17]。而基于黄芩鲜药材产地加工方法的研究，只有部分报 道[18-20]，大都以比较研究阴干、晒干、烘干等不同干燥方法对黄芩苷等指标成分的影响，尚未形成完整的鲜切加工技术体系和质量控制体系。因此，本实验通过外观性状、浸出物含量、有效成分含量对黄芩进行质量评价，结合指纹图谱对趁鲜加工进行研究，探讨黄芩趁鲜加工代替传统加工的可行性，寻找黄芩最佳加工工艺，旨在为黄芩产地加工以及质量标准制定提供科学依据。

1 仪器与试药

Waters1525 二元高效液相色谱仪、Waters2996二极管阵列检测器、Waters Symmetry C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Empower 2 色谱分析软件，美国Waters 公司；优普超纯水机，上海优普科技公司；BSA224S-CW 型万分之一天平，赛多利斯科学仪器北京有限公司；Precisa 225SM-DR 型十万分之一天平，上海精科天美科学仪器有限公司；XMTD-8222 型电热恒温水浴锅、DHG-9240A 型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；BJ-150 型多功能粉碎机，德清拜杰电器有限公司；Eppendorf 5430R 型高速冷冻离心机，北京世贸远东科学仪器有限公司；SB25-12 DTD型超声波清洗机，功率600 W，频率40 kHz，宁波新芝生物科技股份有限公司。

对照品黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素，批号分别为 P20A9F59353、R27M10F89336、C07M10Y87479、T11J11R108209，上海源叶生物公司；甲醇，色谱纯，德国Merck 公司；磷酸，色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；超纯水，自制；甲醇、乙醇，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。黄芩鲜药材于2020年3月采挖于陕西省铜川市宜君县黄芩基地，经浙江理工大学梁宗锁教授鉴定为唇形科黄芩属植物 5年生黄芩S.baicalensisGeorgi 的干燥根。

2 方法与结果

2.1 黄芩加工方法

2.1.1 趁鲜加工 将采挖后的新鲜黄芩根条除去泥土及杂质后，按照表1 加工处理后，切制1～2 mm薄片，60 ℃烘干。共13 组，每组重复3 次，编号S1～S13。

2.1.2 传统加工 将采挖后的新鲜黄芩根条除去泥土及杂质后，按照表1 加工处理，使至完全干燥，湿热软化后切制1～2 mm 薄片，60 ℃烘干。共3组，每组重复3 次，编号S14～S16。

2.2 不同加工方法对黄芩含水率及外观性状影响

水分测定方法参考《中国药典》2020年版四部0832 水分测定法中的第二法烘干法[21]。结果见表1和图1。所有批次的黄芩干燥后的含水率在4.13%～5.51%。阴干加工处理含水率在27.63%～42.33%时切制，干燥后其切面与传统阴干较接近，没有发绿现象，其余阴干批次饮片均发绿。自然干燥加工处理含水率在20.45%～43.12%时切制，干燥后其切面与传统自然干燥较接近，无发绿现象。60 ℃烘干加工处理无论趁鲜加工还是传统加工饮片切面严重发绿，甚至呈现褐绿色。

表1 切制前不同加工处理黄芩药材基本信息及不同加工方法黄芩药材性状比较Table 1 Basic information of different processing of S.baicalensis before cutting and comparison of properties of S.baicalensis with different processing methods

2.3 浸出物测定

醇溶性浸出物参考《中国药典》2020年版四部2201 浸出物测定法中的热浸法，以稀乙醇代替水为溶剂[21]。结果见表2。所有批次加工处理后的黄芩饮片浸出物含量均达标，黄芩醇溶性浸出物在44.16%～52.05%，S3 最大，S1 最小。

2.4 指纹图谱研究

2.4.1 色谱条件 Waters Symmetry C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.2%磷酸水溶液，体积流量0.8 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL，检测波长277 nm，梯度洗脱：0～10 min，30%～40%甲醇；10～20 min，40%～50%甲醇；20～30 min，50%甲醇；30～40 min，50%～60%甲醇；40～50 min，60%～70%甲醇；50～60 min，70%～30%甲醇。

2.4.2 对照品溶液制备 精密称取黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素各对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为2 871.80、1 000.00、657.50、100.00 μg/mL 的混合对照品溶液，于4 ℃冰箱中避光保存备用。

2.4.3 供试品溶液制备 精密称取黄芩中粉0.2 g，于具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇溶液25 mL，精密称定质量，超声提取（功率600 W，频率40 kHz）40 min，放冷至室温，补足减失的质量，摇匀，滤过，滤液过0.22 μm 滤膜，即得供试品溶液。

2.4.4 重复性试验 取同一批黄芩粉末（S5）6 份，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。结果主要共有峰的相对保留时间的RSD 在0.61%～0.74%，主要共有峰的相对峰面积RSD 在1.67%～2.21%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 精密性试验 取同一份黄芩供试品溶液（S5），按“2.4.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录色谱图。结果主要共有峰的相对保留时间的RSD在0.44%～1.77%，主要共有峰的相对峰面积RSD在0.45%～1.44%，表明仪器精密性良好。

2.4.6 稳定性试验 取同一份黄芩供试品溶液（S5），按“2.4.1”项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、12、24 h 进样分析，记录色谱图。结果主要共有峰的相对保留时间的RSD≤1.16%，主要共有峰的相对峰面积RSD 在0.45%～2.34%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

图1 不同加工处理黄芩外观性状差异Fig.1 Differences in appearance characteristics of different processing S.baicalensis

表2 切制前不同加工处理下黄芩的浸出物 ( ± s, n = 3)Table 2 S.baicalensis extract content of different processing before cutting ( ± s, n = 3)

表2 切制前不同加工处理下黄芩的浸出物 ( ± s, n = 3)Table 2 S.baicalensis extract content of different processing before cutting ( ± s, n = 3)

与S14 比较：*P＜0.05；与S15 比较：#P＜0.05；与S16 比较：&P＜0.05（同一种干燥方式的趁鲜加工与传统加工相比较），表6 同*P ＜ 0.05 vs S14; #P ＜ 0.05 vs S15; &P ＜ 0.05 vs S16 (compared with traditional processing in the same drying method), same as table 6

编号 醇溶性浸出物/% RSD/% 编号 醇溶性浸出物/% RSD/%S1 44.16±0.72*#& 1.63 S9 48.23±0.28# 0.58 S2 49.35±0.26* 0.54 S10 46.92±0.16& 0.34 S3 52.05±0.62* 1.20 S11 48.98±0.76 1.55 S4 46.82±0.16* 0.34 S12 47.14±1.03& 2.18 S5 44.50±0.08* 0.19 S13 47.25±1.35& 2.86 S6 48.58±0.05# 0.11 S14 48.18±0.50 1.03 S7 49.72±0.12 0.24 S15 50.17±0.72 1.44 S8 46.76±0.57# 1.21 S16 49.53±0.81 1.64

2.4.7 不同加工处理的黄芩指纹图谱建立及相似度评价 将16 批黄芩供试品HPLC 图谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”，设定S1 为参照图谱，采用中位数法，时间窗宽度为0.1，进行多点校正，进行匹配，生成对照图谱（R），结果见图2。共标定22 个共有峰（占总峰面积90%以上），经过加入对照品，比对保留时间，共指认了4个色谱峰，分别为11 号色谱峰黄芩苷，16 号色谱峰汉黄芩苷，19 号色谱峰黄芩素，21 号色谱峰汉黄芩素，结果见图3。以16 号共有峰为参照峰，各共有峰相对保留时间RSD 在0.066%～0.770%，结果见表3。而共有峰的相对峰面积RSD 均远大于5%（表4）。这表明不同加工处理下黄芩的化学成分组成基本一致，但同一种化学成分的含量差异很大。16 批样品相对于对照图谱的相似性分析见表5。相似度在0.992～1.000，相似度较高。

图2 16 批不同加工处理黄芩指纹图谱Fig.2 Fingerprints of 16 batches of different processing S.baicalensis

2.4.8 聚类分析 将16 批不同加工处理的黄芩饮片的HPLC 指纹图谱中的22 个共有峰峰面积相对于药材称样量量化，运用SPSS 24.0 软件进行系统 聚类分析，采用组间联接法，平方欧氏距离作为样品的距离度，结果见图4。分析结果显示，在类间距离为5 时，16 个样品可以聚为4 类，其中S5、S6 为第1 类，S1、S10～S13、S16 为第2 类，S2～S4 为第3 类，S7～S9、S14、S15 为第4 类。所有烘干处理全部聚为一类，而其他处理即使干燥方法一致，含水率不同时切制，干燥后也可能聚为不同类，同一种干燥方式下的趁鲜加工和传统加工也聚为不同类别。样品来源均为铜川5年生黄芩，却归属不同类，可能与药材加工处理方法的不同有关。说明不同的加工处理会直接影响药材质量。

2.5 黄芩中4 种有效成分含量的测定

2.5.1 色谱条件 同“2.4.1”项。在此条件下，各色谱峰都能很好地分离，色谱图见图3。

图3 混合对照品的HPLC 图 (A) 及黄芩药材HPLC 对照指纹图谱 (R)Fig.3 HPLC of mixed reference substances (A) and HPLC reference fingerprint of S.baicalensis (R)

2.5.2 对照品溶液制备 同“2.4.2”项。

2.5.3 供试品溶液制备 同“2.4.3”项。

2.5.4 线性关系考察 精密吸取已配制好的混合对照品溶液0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.50 mL，分别置于5 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得系列混合对照品溶液。精密吸取上述混合对照品溶液各10 μL，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定。以峰面积为纵坐标（Y），对照品溶液质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程分别为黄芩素Y＝6.29×107X－3.92×105，R2＝0.999 8，线性范围6.58～657.50 μg/mL；汉黄芩素Y＝7.21×107X－1.92×104，R2＝0.999 7，线性范围1.00～100.00 μg/mL；黄芩苷Y＝4.36×107X－8.20×104，R2＝0.999 7，线性范围28.72～2 871.80 μg/mL；汉黄芩苷Y＝5.27×107X－4.67×105，R2＝0.999 6，线性范围10.00～1 000.00 μg/mL。

表3 16 批不同加工处理的黄芩图谱共有峰的相对保留时间Table 3 Relative retention time of common peaks of 16 batches of different processing of S.baicalensis

表4 16 批不同加工处理的黄芩图谱共有峰的相对峰面积Table 4 Relative peak areas of common peaks of 16 batches of different processing S.baicalensis

续表4

表5 16 批不同加工处理的黄芩图谱共有峰相似度结果Table 5 Similarity results of common peaks of 16 batches of different processing S.baicalensis

2.5.5 加样回收率试验 取同一批黄芩粉末（S5）6 份，按各成分在药材中含量的差异，每份加入适量对照品，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进行测定，分别计算各对照品的回收率。结果黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的平均加样回收率依次为 104.83%、102.66%、96.92%、100.38%，RSD 依次为2.34%、0.96%、3.52%、1.71%，表明该方法回收率良好。

图4 不同加工处理的黄芩聚类分析图Fig.4 Cluster analysis diagram of S.baicalensis under different processing

2.5.6 有效成分含量测定 将16 批不同加工处理的黄芩按“2.4”项下方法制备并进行进样检测，结果见表6。阴干条件下，在含水率27.63%时切制，趁鲜加工黄芩苷与汉黄芩苷含量最高，此时与传统加工无显著差异；黄芩素含量和汉黄芩素含量均显著高于传统加工，在含水率为63.66%时切制含量最高，分别比传统加工高2.72 倍和1.66 倍。

表6 切制前不同加工处理下黄芩药材有效成分含量 ( ± s, n = 3)Table 6 Content of effective ingredients of S.baicalensis under different processing before cutting ( ± s, n = 3)

表6 切制前不同加工处理下黄芩药材有效成分含量 ( ± s, n = 3)Table 6 Content of effective ingredients of S.baicalensis under different processing before cutting ( ± s, n = 3)

编号 质量分数/% 黄芩苷 汉黄芩苷 黄芩素 汉黄芩素 S1 15.126 1±0.123 7*# 2.723 5±0.010 2*#& 2.516 8±0.030 8*#& 0.579 5±0.004 9*#& S2 17.923 2±0.169 2* 3.498 8±0.031 1* 1.360 5±0.026 0* 0.409 9±0.010 1* S3 18.595 3±0.246 0 3.107 0±0.023 3* 1.485 4±0.016 9* 0.313 5±0.003 5* S4 17.979 1±0.433 9* 3.252 2±0.019 0* 1.599 0±0.048 7* 0.299 0±0.005 3* S5 19.265 3±0.178 9 3.613 7±0.044 2 1.190 7±0.022 5* 0.196 6±0.003 5* S6 16.415 0±0.098 6# 2.969 2±0.049 7# 1.132 3±0.038 8# 0.287 1±0.006 1# S7 19.031 1±0.239 3 3.820 0±0.013 0# 0.930 4±0.012 1# 0.246 8±0.001 9# S8 20.112 7±0.363 0# 3.568 4±0.002 8# 0.906 3±0.012 0# 0.196 5±0.001 0 S9 18.986 4±0.262 9 3.621 7±0.028 7# 0.753 1±0.003 1# 0.254 9±0.001 2# S10 15.913 7±0.135 6& 3.281 4±0.033 0& 1.740 1±0.012 2 0.463 7±0.002 9 S11 16.262 2±0.344 8& 3.173 2±0.030 2& 2.050 3±0.010 2& 0.546 5±0.004 3& S12 15.031 6±0.077 5 2.922 8±0.012 6 2.224 5±0.011 2& 0.567 3±0.003 8& S13 16.012 5±0.093 2& 2.865 4±0.053 6 1.787 6±0.056 7& 0.437 9±0.010 2& S14 18.914 1±0.254 8 3.614 4±0.038 1 0.676 2±0.013 0 0.217 6±0.004 9 S15 18.859 9±0.607 8 4.024 0±0.014 1 0.501 0±0.007 5 0.199 2±0.001 0 S16 15.197 1±0.118 6 2.905 3±0.049 9 1.712 7±0.031 1 0.474 3±0.008 1

自然干燥条件下，在含水率为25.66%时切制，趁鲜加工黄芩苷含量最高，比传统加工高0.07 倍，含水率20.45%和35.22%时切制，干燥后黄芩苷含量和传统加工相比无显著差异；汉黄芩苷含量均显著低于传统加工；黄芩素和汉黄芩素含量大都高于传统加工，在含水率为63.66%时切制，含量最高，分别比传统加工高4.02 倍和1.91 倍。

60 ℃烘干条件下，趁鲜加工含水率为49.81%时切制，黄芩苷含量最高，比传统加工高0.07 倍，含水率19.22%和57.04%次之；在含水率57.04%时切制，汉黄芩苷含量最高，比传统加工高0.13 倍，含水率49.81%次之；在含水率63.66%时切制，黄芩素和汉黄芩素含量均最高，分别比传统加工高0.47 倍和0.22 倍。

3 讨论

不同加工处理的黄芩干燥后对外观性状的影响较大。研究表明，黄芩苷等苷类成分在高温湿热环境中，稍不注意就会加速酶解，导致含量降低，进而影响质量。阴干在含水率较高（52.82%以上）时切制，由于饮片本身的含水率高，置于60 ℃干燥时，饮片受自身较高水分和烘箱温度的影响，会促进苷类的酶解，致使切面发绿。而黄芩无论烘至含水率多少切制，干燥后饮片外观颜色都有不同程度发绿，大大影响饮片美观。黄芩栓皮较厚，透气性差，即使含水率降至很低切制，由于温度相对较高，随着烘干时间的延长，根条也未切制，致使根条内部持续发热，内部的热气无法发散出去，为一系列复杂的酶促、氧化、聚合等生化反应创造了有力条件，黄芩苷被酶解为黄芩素[22-24]。黄芩素结构中含有3 个邻位的酚羟基，易被氧化转变为醌类衍生物而显绿色[25]。黄芩变绿后，有效成分受到破坏，质量随之降低。

指纹图谱研究通过对黄芩的各个化学成分进行整体评价，标定了许多共有峰。除此之外对《中国药典》规定以外的一些其他成分进行含量测定，指认除《中国药典》规定的其他成分。并进行指纹图谱的相似性分析、相对保留时间和相对峰面积的分析，更能全面反映出不同加工处理的黄芩药材的质量是否均一，化学成分相差是否较大。本研究通过外观性状差异、浸出物含量、有效成分含量，结合指纹图谱，得出最佳干燥工艺为自然干燥至含水率20.45%～35.22%时对黄芩进行切制，60 ℃烘干。在聚类分析中，自然干燥至含水率20.45%～35.22%时切制并60 ℃烘干的饮片，与相应的传统加工聚为一类，进一步说明了趁鲜加工可以代替传统加工。趁鲜加工在保障药材质量的同时，省时省力，节省成本，也避免了二次加工中有效成分的流失。本研究为黄芩的产地加工、质量标准建立提供了重要的参考价值。此外，不同加工方法导致药材的质量差异，进而影响临床疗效，因此不同加工方法引起的药效变化有待进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突