冬虫夏草中砷及其安全性评价研究进展

肖远灿，李 岑，杨红霞，杜玉枝，张 明，毕宏涛，魏立新*

1.中国科学院 西北高原生物研究所，青海省藏药药理学和安全性评价研究重点实验室，青海 西宁 810008

2.中国科学院藏药研究重点实验室，青海 西宁 810008

3.中国科学院大学，北京 101408

冬虫夏草是我国名贵中药材，为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordyceps sinensis(Berk.) Sacc.寄生于蝙蝠蛾科昆虫幼虫形成的虫菌复合物[1]，自然分布于我国青海、西藏、四川、甘肃和云南等地区，生长在海拔3000 m 以上的高寒草地、高山草甸和高山灌丛[2]。冬虫夏草味甘，性平，归肺、肾经，具有补肾益肺、止血化痰的功效[1]，还具调节免疫[3]、抗肿瘤[4]、抗疲劳[5]、治疗2 型糖尿病[6]等众多的药理活性。

冬虫夏草中砷超标及其安全性问题由来已久[7]，2016年2月4日国家食品药品监督管理总局发布“关于冬虫夏草的消费提示”，提示消费者“冬虫夏草、冬虫夏草粉及纯粉片产品中，砷含量为4.4～9.9 mg/kg”“长期食用冬虫夏草、冬虫夏草粉及纯粉片等产品会造成砷过量摄入，并可能在人体内蓄积，存在较高风险”[8]。

砷是一种广泛存在于自然界的类金属元素[9]，其毒性依赖于其存在的化学形态，无机砷具有较高毒性，被列入I类致癌物质中，有机砷毒性较小或没有毒性[10]。此外，含砷物质的毒性还受到生物可给性和生物利用度的制约[11]。本文对近年来冬虫夏草中砷及其安全性的研究进展进行归纳总结，从保障人民群众用药安全和增加对冬虫夏草中砷认知的角度对冬虫夏草中砷的研究进行展望，以期为冬虫夏草的安全性评价及合理用药研究提供参考。

1 冬虫夏草中的总砷

1.1 总砷的分析方法

1.1.1 样品消解方法 微波消解[7,12-38]和湿法消解[12,39-41]是冬虫夏草样品消解的2 种主要方式。微波消解均采用以硝酸和硝酸为主的混合酸体系及程序升温的方法，湿法消解都采用了混合酸溶液。硝酸为冬虫夏草样品消解的主要消解溶剂，用量5～20 mL；以硝酸为主的混合酸包括硝酸与过氧化氢、盐酸、高氯酸等。冬虫夏草总砷测定的样品用量0.05～1.0 g，且多为0.2～0.5 g。

1.1.2 仪器分析方法 冬虫夏草总砷含量分析的仪器方法有电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法、原子荧光光谱（AFS）法、石墨炉原子吸收（GFAAS）法和电感耦合等离子体发射光谱（ICP-AES）法。ICP-MS 法以其定性准确，灵敏度高，检出限低，样品用量少等优点得到广泛应用，成为冬虫夏草中砷含量分析的主流方法。AFS 法、GFAAS 法和ICPAES 法在冬虫夏草中总砷的分析中应用相对较少。冬虫夏草中总砷含量测定的检出限、定量限、加样回收率等方法学数据见表1。

表1 冬虫夏草中总砷测定的方法学数据Table 1 Methodology data of total arsenic determination of Cordyceps sinensis

1.2 冬虫夏草中总砷含量

文献报道了307 批次西藏、青海、四川、甘肃、云南等地产野生冬虫夏草样品中总砷含量的分析结果，质量分数为0.052～24 mg/kg，仅有7 批次[7,20,27,39-40]质量分数低于2 mg/kg，最高24 mg/kg 的样品采自西藏比如县[21]。20 批次[21,29,37]人工繁育冬虫夏草中总砷含量均低于2 mg/kg，其中鲜样中总砷0.07～0.13 mg/kg[29]，干品中总砷0.223～0.5 mg/kg[21,37]。砷在野生冬虫夏草中的含量：虫体＞子实体，子实体中的总砷均低于2 mg/kg，且虫体总砷是子实体的7～13 倍[25,34]，见表2。总体上看，野生冬虫夏草中总砷含量均较高，而人工繁育冬虫夏草中总砷均能满足《中国药典》2020年版对植物药的限量要求。

表2 不同产地冬虫夏草中总砷含量Table 2 Content of total arsenic in C.sinensis from different origins

2 冬虫夏草中的砷形态

砷对生物体的毒性与其化学形态密切关联，亚砷酸根（iAsⅢ）和砷酸根（iAsV）对人体细胞的半数致死剂量（median lethal dose，LD50）分别为5.49、571 μmol/L，而砷糖、砷脂等有机砷的LD50值远大于iAsⅢ和iAsV，为低毒或无毒[10]。因此，仅以总砷含量来判断冬虫夏草的安全性较为片面，采用砷形态分析结果能够更为准确地评价其安全性。

2.1 常见砷形态的分析

2.1.1 常见砷形态的分析方法 高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用（HPLC-ICP-MS）法、离子色谱-电感耦合等离子体质谱联用（IC-ICP-MS）法和高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光联用（HPLC-HG-AFS）法是目前用于冬虫夏草中砷形态分析的3 种主要方法，其中又以HPLC-ICP-MS 法在冬虫夏草砷形态分析中应用最多。已报道的冬虫夏草中常见砷形态分析的成分有iAsⅢ、iAsV、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）、砷胆碱（AsC）和砷甜菜碱（AsB）。

（1）提取及样品溶液制备：提取是冬虫夏草中砷形态分析至关重要的步骤，有效、真实地提取样品中的砷形态成分并保持其在检测前的稳定为准确获取冬虫夏草中的砷形态数据提供了必要前提。冬虫夏草中砷形态分析采用的提取溶剂及溶液制备方法见表3。

表3 冬虫夏草砷形态分析中的样品溶液制备Table 3 Sample solution preparation for arsenic speciation analysis of C.sinensis

（2）分离及检测：冬虫夏草中砷形态的分离采用了阴离子交换色谱柱，使用的色谱柱、流动相体系、体积流量、柱温、进样量和分离组分的检测方式等分析条件以及方法学数据见表4。

表4 冬虫夏草中砷形态的分离条件及检测方法学数据Table 4 Separation conditions and determination method data of arsenic speciation in C.sinensis

2.1.2 冬虫夏草中常见砷形态分析结果 冬虫夏草中砷形态分析报道较少，且报道中得出的冬虫夏草中砷形态的种类和含量差异很大，见表5。文献报道了来源于西藏、青海、四川和云南等地89 批次野生冬虫夏草和东阳光公司15 批次人工繁育冬虫夏草中砷形态的分析结果。结果显示，冬虫夏草中均检出了iAsⅢ，大都检出了iAsV，少数样品检出了MMA、DMA 和AsB。采用1.4 mol/L 硝酸溶液70 ℃微波对冬虫夏草中砷有最高的提取率，达（99.85±0.007）%（n＝34）[36]，纯水超声对砷形态的提取率最低，仅为0.14%～1.48%（n＝32）[31]。2%、0.15 mol/L 稀硝酸对野生冬虫夏草中无机砷的提取率不高于8.69%[34-35]，对人工繁育冬虫夏草的提取率分别高达87.0%～104.2%[37]和85.5%[42]。人工胃液提取出的无机砷占冬虫夏草总砷的6.80%～16.83%[23]和2.33%[34]。2%稀硝酸对野生冬虫夏草子实体和虫体中无机砷的提取率分别为34.20%、6.45%[34]。

表5 不同来源冬虫夏草中砷形态分析结果Table 5 Arsenic speciation analysis results of C.sinensis from different origins

2.2 冬虫夏草中砷的溶出形态

砷的溶出及溶出砷形态研究对增加冬虫夏草中砷的认知具有积极意义。陈炜等[32]采用Tessier 连续提取法对冬虫夏草中砷的溶出形态进行了研究。Tessier 连续提取法将重金属形态分为水溶态和交换态、碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态、有机结合态和残渣态等5 态，已被广泛应用于土壤和沉积物重金属形态的分析中[33]。该研究采用80%乙醇、去离子水、1.0 mol/L 氯化钠溶液、2.0%醋酸和0.6 mol/L 盐酸对青海冬虫夏草粉末进行了依次连续提取。结果表明，冬虫夏草大部分的砷（2.187 5±0.039 7 μg/g，占总砷的42.37%）在残渣中，去离子水、80%乙醇、1.0 mol/L 氯化钠、2.0%醋酸和0.6 mol/L 盐酸溶液提取物中砷在总砷中的占比分别为 28.43%、13.32%、13.34%、2.38%、0.15%。

2.3 冬虫夏草中的未知结构砷形态

未知结构砷形态的发现是近几年来冬虫夏草砷研究的重要成果，为冬虫夏草砷的深入研究提供了参考。对于野生冬虫夏草中存在未知结构砷的推断金鹏飞等[17]、曹晓钢等[31]、Zhou 等[34]、Guo 等[35]和邵劲松等[44]均有报道，但对未知砷的深入研究极少。

Li 等[38]以阴离子交换色谱柱和分子排阻色谱柱为分离手段，采用ICP-MS 和HPLC-ICP-MS 技术，结合模拟胃液提取、不同比例硝酸溶液提取和纯水、5% NaCl 溶液、0.08 mol/L NaOH 溶液、70%乙醇溶液依次提取方法对野生冬虫夏草中砷的溶出、砷形态在提取过程中的转化、砷在化学成分中的分布等进行了研究。结果表明，模拟胃液溶出砷占总砷的52%，其中无机砷仅占总砷的约4%；阴离子色谱-HPLC-ICP-MS 法仅能检出溶出砷中8%的游离无机砷；分子排阻-高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用（SEC-HPLC-ICP-MS）法图谱显示有含量较高的未知砷存在。砷在冬虫夏草碱性蛋白中含量最高，在脂溶性成分、盐溶性蛋白、醇溶性蛋白和多糖中均有分布。

3 冬虫夏草砷的安全性评价

3.1 安全性分析方法

冬虫夏草砷的安全性是近几年人们关注的焦点，通过现有方法评价冬虫夏草砷的安全性能够提供冬虫夏草初步的安全性数据。目前，对冬虫夏草中砷进行健康风险评价的研究[24,34-36,38]均采用了美国国家环境保护局（U.S.Environmental Protection Agency，US EPA）长期暴露的非致癌风险模型和致癌模型[45]。非致癌风险评价模型采用靶标危害系数（target hazard quotients，THQ）对污染物长期健康风险进行评价，而致癌风险评价是在其基础上引入了致癌斜率系数，模型的计算式如下。

计算公式中，EDI 为砷的平均每日摄入量[mg/(kg·d)]；C为冬虫夏草中砷的浓度（mg/kg）；FIR 为每日冬虫夏草摄入量[g/(person·d)]；EF 为暴露频率（d/a）；ED 为暴露年限（a）；BW 为平均体质量（kg）；TA 为暴露时间（d）；1000 为计量单位（g 到kg）换算系数；THQ 为靶标危害系数；RFD为砷的每日允许最大摄入量[mg/(kg·d)]；R 为终身致癌风险；SF 为致癌斜率系数。当THQ≤1 时被认为对人体健康的影响不明显；世界卫生组织（world health organization，WHO）对R 的建议值为1×10−5；RFD 和SF 的取值来源于US EPA 或WHO[46-50]。

3.2 基于砷的安全性评价

文献中基于各自对冬虫夏草中总砷、生物可给性砷、无机砷等含量的实验分析结果和ED、EF、BW、TA 等参数的不同设定，对冬虫夏草砷的安全性进行了评价，得出了不同的结果，见表6。

表6 冬虫夏草中砷的健康风险评价Table 6 Health risk evaluation of arsenic in C.sinensis

文献中对EF、ED 的设定值和获得的冬虫夏草中总砷含量的差别是造成健康风险评价结果差异的主要原因。

卢恒等[24]分析了北京市售15 批冬虫夏草样品中总砷含量，均值4.032 mg/kg，计算得到致癌风险R 为6.39×10−5，高于WHO 建议的1×10−5；在引入曹晓钢等[31]得出的冬虫夏草中无机砷占总砷的平均比例0.485%后，将R 值校正为3.09×10−7，并以此为依据认为冬虫夏草中的砷不具有致癌风险。Zhou 等[34]对产自青海的3 个野生冬虫夏草样品进行了总砷和生物可利用砷（人工胃肠液提取）分析，获得生物可利用砷占总砷的64.46%，生物靶标危害系数（BTHQ）为0.533 4，在设定的前提下没有明显健康风险。

Guo 等[35]将分别产自那曲、理塘和玉树的12 个冬虫夏草样品进行了总砷和砷形态分析，分别从总砷、无机砷、无机砷＋未知砷等不同角度计算了长期食用风险；结果表明将未知砷设定为无毒和仅以无机砷计算时，冬虫夏草砷没有长期健康风险。Zuo等[36]采用34 个来自西藏、青海、甘肃和云南的冬虫夏草样品中总砷和无机砷检测数据对中国男性和女性冬虫夏草砷长期暴露风险进行了评价，结果表明当每年暴露频率小于2 个月时，冬虫夏草砷对人健康风险较小。

Li 等[38]以17 批次来自西藏、青海、甘肃和云南的冬虫夏草中总砷、无机砷和生物可给性砷的分析结果为基础进行了健康风险评价，得出了冬虫夏草砷的健康安全性不容忽视的结论。

4 冬虫夏草中砷含量的限量标准

安全有效和质量可控是药品的基本属性，也是保障人民群众用药安全的必然要求，对药品中重金属和有害元素进行限量是确保用药安全的有效手段之一。然而，目前对于冬虫夏草药材中砷的限量标准并不十分明确。

4.1 限量标准的来源

文献在判别冬虫夏草中总砷含量是否超标时引用的标准包括2001年《药用植物及制剂进口绿色行业标准》[51]，《中国药典》2005年版[52]、2010年版[53]和2015年版[1]，《食品安全国家标准 保健食品》[54]，2015年由中国制定的《中医药-中药材重金属限量》国际标准[55]和《食品安全国家标准 食品中污染物限量》[56]等。

4.2 相关标准的解读

《药用植物及制剂进口绿色行业标准》[51]中对植物药材及制剂的总砷限量为2 mg/kg。自1965年版收载冬虫夏草以来，历版《中国药典》[1,52-53,57]均未对冬虫夏草中砷的残留量进行限定。《中医药-中药材重金属限量》国际标准[55]中根据我国中药材重金属的具体情况，制定的中药材中总砷限量值为4 mg/kg。《食品安全国家标准 保健食品》[54]将保健食品中总砷的限量标准值定为1 mg/kg。《食品安全国家标准 食品中污染物限量》[56]按照食品的不同种类对总砷的限量值为0.1～0.5 mg/kg。

4.3 砷限量标准的适用性分析

通过对上述冬虫夏草研究报道中引用的砷限量标准的解读，作为中药材，文献报道的某些冬虫夏草样品中总砷的含量超过了国际标准[55]4 mg/kg 的限量。在没有明确的砷限量标准的情况下，为最大限度地保障人民群众的用药安全和食品安全，参考如《药用植物及制剂进口绿色行业标准》[51]、《中国药典》[1,52-53]植物类药材砷的限量标准，以及现行的食品和保健食品安全标准（虽然冬虫夏草从2010年以来已经被明令禁止作为食品和食品原料[58]，但在民间冬虫夏草仍然常作为食疗保健品使用）来评价冬虫夏草中砷的超标情况具有一定的合理性和可操作性。同时，目前冬虫夏草中砷没有明确限量的情况也提示从保障人民群众用药安全和食品安全角度，对冬虫夏草中砷开展深入的研究十分必要。

5 冬虫夏草中砷研究存在的问题

冬虫夏草中砷的基础研究薄弱。已有的研究报道大多数以测定冬虫夏草的总砷含量为主要内容，少数的研究涉及砷形态和生物可给性的探讨，研究中仅能推断冬虫夏草中含有大量的结合态未知砷[38]。由于冬虫夏草药材本身价格昂贵，研究成本高，其深入研究极少。

针对冬虫夏草中砷的研究方法有待建立。现阶段对冬虫夏草中砷形态分析的方法多借鉴采用食品砷形态分析的分析方法[59]，且不同的研究者采用的提取溶剂体系差异较大，提取温度和提取时间又各不相同，造成结果的较大差别，数据可比性差。

冬虫夏草中砷的安全性评价均采用了US EPA的长期健康风险评价和致癌风险评价方法，这些方法基于总砷含量，且其模型主要针对环境中的无机砷，是否适合作为含有含量较高未知砷的中药材的安全性评价模型值得探讨[45]。

6 结语与展望

近年来对冬虫夏草中砷的研究逐渐增多，并不断深入，不同产地冬虫夏草中总砷和砷形态分析数据不断积累，冬虫夏草中砷的暴露分析和基于总砷含量的安全性评价也陆续开展，采用污染物和致癌物评价模型初步获取了冬虫夏草砷的安全性评价数据，推断并间接验证了未知结构砷形态的存在。然而，对冬虫夏草中砷的认知还很有限，冬虫夏草中砷存在形态的精准分析方法有待建立和完善，未知结构砷需要引入先进技术探索解析，基于砷形态成分代谢的毒理学机制仍需继续深入研究，针对冬虫夏草自身特征、用药特点的安全性评价模型也有待研究和建立。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突