基于网络药理学的黄连干预幽门螺杆菌作用机制探讨△

陈秋霞，黄安，梁冬媚，庞宇舟，2*

1.广西中医药大学 壮医药学院，广西 南宁 530001；2.广西壮瑶医药与医养结合人才小高地，广西 南宁 530000

幽门螺杆菌(Hp)属于一种螺旋状的革兰阴性菌，可长期定植于人类胃黏膜中，是世界上最顽固的慢性致病菌之一。Hp感染不仅与胃肠道疾病相关，还可能参与消化系统外的血液系统、神经系统、内分泌系统、心血管系统及免疫系统等疾病的发生，如胃炎、胃癌、冠心病、皮肤超敏反应、骨质疏松、糖尿病等[1]。Hp感染具有感染率高、病程长、容易复发的特点，严重威胁患者的生命健康。西医治疗Hp主要以三联疗法或四联疗法为主，临床上虽取得一定的疗效，但由于抗菌药物的耐药性、患者的个体差异、药物的不良反应及治疗的不规范性等因素导致Hp的根除率有所下降[2]。因此，从中医药中寻求新的Hp感染抑制药物已成为重要的研究方向。

中医认为，Hp属于“外来邪气”，与湿热病邪之间存在密切联系。诸多实验和临床研究都表明，脾胃湿热的环境下Hp感染率较高[3]。因此，清热祛湿药在抑制Hp方面发挥了巨大的作用。已有文献报道，黄连有较好的抑杀Hp的作用，且与其他清热药比较，其对Hp多重耐药株的最小抑菌浓度(MIC)值最小，抑菌作用强[4]。黄连抑菌的有效成分一般认为是小檗碱，其具有广谱抗菌作用，抗菌疗效明显，抗菌机制可能是通过抑制细菌的葡萄糖及糖代谢中间产物的氧化过程，特别是脱氧反应，从而消灭细菌[5]。黄连乙醇提取液及盐酸小檗碱的体外抗Hp实验结果显示，黄连与小檗碱均有抗菌活性，黄连的抗菌活性相对较好[6-7]。且黄连中黄连碱、小檗碱、巴马汀、表小檗碱和药根碱5种生物碱均能有效地抑制Hp的活性，抗菌作用效果依次为黄连碱、小檗碱、巴马汀、表小檗碱、药根碱。临床研究显示，小檗碱联合铋剂四联疗法可显著提高Hp根除率，促进消化性溃疡的愈合，效果优于单纯铋剂四联疗法[8]。目前，黄连或其成分干预Hp的作用机制尚不明确，可能由多种成分互相协作共同达到抗菌的效果。为此，本研究基于网络药理学分析黄连有效成分作用于Hp的靶点，探讨其抑菌的作用机制和物质基础，以期为Hp引起的疾病治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 黄连药效成分筛选

利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)搜索黄连，得到黄连所有化学成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug-likeness，DL)≥0.18作为筛选标准。由于其有效成分可在胃肠道内直接发挥抗Hp作用，故直接采用Perl(https：//www.perl.org/)软件对相关有效成分作用靶点进行预测。

1.2 药效成分靶点预测

在TCMSP数据库中搜索黄连的相关靶点，将筛选得到的靶蛋白输入到UniProt(ttp：//www. uniprot.org/)数据库中，得到相应的靶点名称，运用Perl软件对筛选出的靶点进行注释。

1.3 疾病靶点预测

利用GeneCards数据库(http：//www.Genecards. org/)和OMIM数据库(http：//www.omim.org/)，以“Helicobacterpylori”为关键词进行搜索，得到与Hp相关的基因，作为疾病的候选靶点。

1.4 药物靶点与疾病靶点交集

运用R语言软件(https：//www.r-project.org/)构建黄连与Hp靶点之间的交集，绘制黄连与Hp靶点的韦恩图。

1.5 构建中药-有效成分-疾病-靶点调控网络

利用Perl软件将获得的黄连-Hp靶点进行一一映射，再运用Cytoscape 3.6.1(http：//www. cytoscape. org)软件对该网络进行拓扑计算，得到中药-有效成分-疾病-靶点调控网络。网络中的节点(node)代表化合物、关键靶点、信号通路、疾病等；边(edge)代表药物-化合物、疾病-靶点、成分-靶点之间的相互作用关系。网络节点度(degree)值代表节点与其他节点相连接的个数或边数。并使用R语言绘制PPI靶点条图。

1.6 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络的构建

为探索靶点-蛋白之间的相互作用，把黄连干预Hp的相关靶点上传至在线STRING 11.0软件(http：//string-db.org/，ver.11.0)，获得PPI数据，构建网络。

1.7 基因本体(GO)功能富集与京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

通过药效成分和相关靶点预测，得到成分靶点相互作用关系和疾病靶点相互作用关系。利用R语言软件对筛选得到的黄连干预Hp的靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。

2 结果

2.1 黄连药效成分筛选结果

通过TCMSP数据库查询黄连药效成分及作用靶点，根据OB≥30、DL≥0.18筛选共得到48个药效成分，分别为小檗碱(berberine)、非洲防己碱(columbamine)、异香兰素(lsovanillin)、绿原酸(heriguard)、爪哇镰菌素(javanicin)、黄柏酮酸(obacunoic acid)、黄皮树碱(obamegine)、花椒碱(fagarine)、2-羧甲基-3-异戊烯基-2，3-环氧-1，4-萘醌(2-carboxymethyl-3-prenyl-2，3-epoxy-1，4-naphthoquinone)、木兰花碱(magnoflorine)、黄柏酮(obacunone)、三羟基蟾蜍甾族胆烷酸(trihydroxybufosterocholanic acid)、小檗红碱(berberrubine)、5，8-二羟基-2-(2-苯乙基)色酮(DPEC)、去四氢碎叶紫堇碱(corydaldine)、表小檗碱(epiberberine)、格兰地新(groenlandicine)、柠檬苦素(limonin)、降氧化北美黄连次碱(noroxyhydrastinine)、黄柏碱(phellodendrine)、咖啡酸乙酯(ethyl caffeate)、氢化小檗碱[(R)-canadine]、小檗浸碱(berlambine)、二氢欧山芹醇当归酸酯(zosimin)、鸡冠花苷A(corchoroside A)、黄麻苷A(corchoroside A_qt)、3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙-2-烯酸(FER)、木兰花碱(magnograndiolide)、掌叶大黄二蒽酮A(palmidin A)、6-O-E-阿魏酰基筋骨草醇(6-O-E-feruloylajugol)、失去糖残基的6-O-E-阿魏酰基筋骨草醇(6-O-E-feruloylajugol_qt)、盐酸巴马汀(palmatine)、药根碱(jatrorrizine)、槲皮素(quercetin)、香草酸(vanillic acid)、羟基酪醇(hydroxytyrosol)、对香豆酸(p-coumaric acid)、黄连碱(coptisine)、直铁线莲宁B(clemastanin B_qt)、粉防己碱(tetrandrine)、甲基黄连碱(worenine)、2，5-二羟基苯甲酸(GENOP)、原儿茶酸甲酯(methyl protocatechuate)、3，4-二甲氧基-肉桂酸[cinnamic acid，3，4-dimethoxy-(8CI)]、密花藤胺(pycnamine)、丹参素(danshensu)、穆坪马兜铃酰胺(moupinamide)、尖刺碱(oxyacanthine)。

2.2 药物-疾病靶点预测结果

在TCMSP数据库查询到黄连靶点581个，运用Perl软件对黄连的药效成分进行基因靶点注释，得到223个靶点。GeneCards数据库和OMIM数据库中分别检索到Hp靶点1878个和28个，将检索到的基因合并去除重复项后，得到黄连靶点99个和Hp靶点1819个。将所得黄连靶点与Hp靶点进行交集比对，筛选出共同靶点62个(图1)。

图1 黄连-Hp靶点韦恩图

2.3 中药-有效成分-疾病-靶点网络构建

为了进一步分析黄连的活性成分与Hp的作用关系，利用Cytoscape 3.6.1软件构建黄连干预Hp的有效成分与作用靶点之间的可视化网络模型(图2)，共得到95个节点和244条相互作用的边。黄连主要通过31个有效成分作用于62个靶点，这62个靶点可能影响Hp的发生。

注：蓝色棱形代表Hp；黄色椭圆形代表Hp的靶基因；紫色三角形代表黄连；绿色箭头代表黄连的有效成分；红色线条代表Hp与靶点之间的作用关系；紫色三角形代表黄连有效成分与靶点之间的作用关系；绿色线条代表黄连与其有效成分之间的作用关系。图2 黄连干预Hp的中药-成分-疾病-靶点调控网络

各节点之间的连线代表这些节点元素之间的作用关系，相连的节点数目越多，这个靶点或化合物在网络中的作用就越关键。由图2可见，与HP靶点连线数目排名靠前的化合物有槲皮素、汉防己甲素、药根碱、盐酸巴马汀、小檗碱、去四氢碎叶紫堇碱等，说明这些化合物在网络中起着重要的调节作用，可能是黄连干预Hp较为关键的成分。且黄连有效成分较集中作用于雄激素受体(AR)、毒蕈碱型胆碱受体M3(CHRM3)、丝氨酸蛋白酶1(PRSS1)、环加氧酶1(PTGS1)、纤溶酶原激活因子(PLAU)、雌激素受体1(ESR1)、V-Rel网状内皮增生病毒癌基因同源物A(RELA)等靶点。

2.4 PPI网络

为了更好地理解黄连干预Hp的作用机制，利用STRING 11.0数据库构建了黄连干预Hp相关靶点的PPI网络(图3)。从结果可以看出，黄连的靶点蛋白之间存在广泛的相互作用，PPI网络包含62个蛋白质节点和467条相互作用关系(连线)。根据R语言绘制的中药-疾病核心靶点条图(图4)，邻接蛋白度值较高的有胱天蛋白酶3(CASP3)、白细胞介素-6(IL-6)、V-Myc骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物(MYC)、雌激素受体1(ESR1)、细胞周期素D1(CCND1)、酪氨酸激酶受体2(ERBB2)、Fos、V-Rel网状内皮增生病毒癌基因同源物A(RELA)、雄激素受体(AR)、过氧化物酶体增生激活受体(PPARG)等，提示这些靶点在黄连抑制Hp的过程中发挥着关键作用。

图3 黄连干预Hp的中药-疾病靶点PPI网络

图4 黄连干预Hp的核心靶点(前30位)

2.5 GO功能富集分析

利用R语言软件对预测出的黄连干预Hp的核心靶点进行GO功能富集分析(图5)。黄连干预Hp的核心基因的GO功能主要涉及DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、激活转录因子结合、DNA结合转录激活活性及RNA聚合酶Ⅱ特异性、DNA结合转录激活活性、泛素样蛋白连接酶结合、泛素蛋白连接酶结合、谷胱甘肽结合、血红素结合、激酶调节活性等。

图5 黄连干预Hp靶点的GO功能富集分析

2.6 KEGG 通路富集分析

构建黄连干预Hp核心靶标的KEGG 通路富集(图6)，黄连干预Hp核心靶点的KEGG 通路主要涉及乙型肝炎信号通路、肝细胞癌信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染信号通路、前列腺癌信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、癌症中的蛋白多糖信号通路、糖尿病并发症中的晚期糖基化产物通过和其受体结合(AGE-RAGE)信号通路、人T细胞白血病病毒1型感染信号通路、人巨细胞病毒感染信号通路、肿瘤坏死因子信号途径信号通路、结直肠癌信号通路等。

图6 黄连干预Hp靶点的KEGG通路富集分析

3 讨论与结论

黄连味苦，性寒，归心、脾、胃、胆、大肠经，具有清热燥湿、泻火解毒的功效。黄连的有效成分和多数Hp靶点存在交互作用，不同的有效成分可作用于相同的靶点，也可作用于不同的靶点，表明黄连是通过多成分、多靶点及多通路协同作用的方式发挥干预Hp的作用。其中，槲皮素、汉防己甲素、含药根碱、盐酸巴马汀、小檗碱等与Hp靶点交互作用较多，提示这些黄连的活性成分在干预Hp中发挥着关键作用。黄连中含有大量的小檗碱，对革兰阳性及阴性菌均有抑菌作用，可以有效地抑制幽门螺杆菌细胞内对葡萄糖的摄取和氧化反应，从而使病菌无法得到充足的营养而凋亡，能抗消化性溃疡、抑制胃酸分泌、保护胃黏膜，抑制Hp作用显著[9]。槲皮素是一种含大量酚羟基的类黄酮，具有较强的清除活性氧和自由基的能力，具备抗氧化、抗炎、抗病毒、抗血栓等生物活性[10]，其中包括对Hp酶的活性。槲皮素可通过降低p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)和Bax的水平、增加Bcl-2的水平、抑制幽门螺杆菌感染相关的细胞凋亡，从而调节胃细胞增殖和凋亡的平衡[11-12]。因此，槲皮素可能是一种防治Hp引起的胃炎的潜在候选药物。汉防己甲素又称粉防己碱，属于一种钙通道阻滞剂的双苄基异喹啉类生物碱。相关研究表明，汉防己甲素具有抑制胃癌细胞增殖，并诱导其发生凋亡和自噬、逆转药物抵抗的作用[13]。通过汉防己甲素对Hp靶点的作用可见，其对由Hp引起的胃部病变亦有一定的治疗效果。另有研究表明，巴马汀也是一种有效的Hp抑制剂，实验也证明巴马汀对4株Hp(ATCC 43504、NCTC 26695、SS1和ICDC 111001)均有抑菌作用[14]。巴马汀还对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和超氧自由基有清除作用，对Hp定植和溃疡产生有抑制作用，被认为是一种新型的保护剂[15]。

黄连干预Hp的核心靶点主要有CASP3、MYC、IL-6、ESR1、CCND1、ERBB2、Fos等。这些靶点可能通过影响DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、激活转录因子结合、DNA结合转录激活活性等细胞因子水平来调控Hp的发生。CASP3蛋白属于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspases)家族，Caspase家族是一类半胱氨酸特异性蛋白酶，与细胞因子成熟和细胞凋亡有关，Caspase-3处于Caspase级联的下游，在凋亡通路末期被激活，是细胞凋亡关键执行蛋白酶之一[16]。其可能参与了胃黏膜正常细胞及受损细胞的凋亡及更新，在多种细胞损伤因子如Hp感染等长期作用下，部分细胞受损，Caspase-3酶原等被损伤信号激活后参与受损细胞的清除[17]。人体出现Hp感染后可介导免疫反应及慢性炎性反应的产生，诱导大量细胞因子及炎性介质的生成。陈一等[18]研究结果表明，IL-6参与了Hp感染后的细胞免疫调节过程，IL-6可抑制Hp感染机体的细胞免疫，激活体液免疫，其水平的高低可作为判定机体免疫情况的指标。MYC即瘤细胞病毒癌基因蛋白，其既能促进细胞增殖，又可介导细胞凋亡，具有双向调节作用。有研究发现，受Hp感染患者的胃癌前病变发生率高于正常人群，在Hp感染患者胃黏膜中C-myc蛋白阳性表达率显著高于未感染患者，说明C-myc蛋白可能通过促进Hp的增殖对胃部产生更多的损害，与胃癌的发展息息相关[19]。此外，黄连中的有效成分还可通过调控其他分子水平对Hp起到干预作用。

在本研究筛选出的信号通路中，与黄连有效靶点的关联度相对较高的有乙型肝炎信号通路、肝细胞癌信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路等。研究表明，Hp感染会导致慢性乙型肝炎(CHB)患者出现胃黏膜病变，乙型肝炎病毒(HBV)感染是导致CHB的直接原因，HBV除具有嗜肝性外，还具有泛嗜性，常可累及胃，同时在胃微血管内皮细胞处形成抗原抗体复合物，导致胃部组织细胞出现炎性反应，使胃黏膜屏障作用减弱而发生溃疡等病变，且溃疡可随HBV的大量复制而逐渐加重[20-23]。Hp具有肝细胞毒性，与慢性肝病进展和肝癌的发生有一定相关性。Hp感染后可诱导一系列的细胞因子上调并构成一个复杂炎症调节网络。多种炎症细胞因子可促进肝内炎症反应，介导肝细胞损伤，诱导各类细胞分化增殖，从而使肝脏慢性炎症持续存在，在一定程度上可诱导肝癌的发生[24]。而黄连有效成分可以通过靶点抑制Hp或阻断细胞因子，对抑制肝细胞损伤有重要意义。此外，剪切应力信号转导涉及细胞膜表面和胞浆内信号转导途径的活化，可通过诱导生长阻滞蛋白的产生和抑制内皮细胞周期[25]。Hp感染会引发、加重患者的炎症反应，改变其血清脂质代谢平衡，进而促进内皮损伤、动脉硬化[26]。因此，对动脉斑块患者行抗Hp治疗可更好地改善颈动脉斑块形态学血流动力学指标及血脂异常。

综上所述，黄连多种有效成分通过调控Hp相关的基因起到干预Hp的作用。本研究可为黄连干预Hp提供一定的依据，也可为临床干预Hp及新型药物的开发提供思路。但本研究主要是借助网络药理学方法分析预测黄连干预Hp可能存在的靶点、通路等，尚存在一些不足之处，若需明确黄连的有效成分对Hp靶点的作用机制或发现新的靶点及药效成分，还需进一步的实验验证。