枯草芽孢杆菌对斜纹夜蛾生长发育及消化酶活性的影响

马自杰，张婉婷，廖美德

(华南农业大学 农学院，广东 广州 510642)

【研究意义】食料对昆虫生长发育的影响不仅仅表现在发育历期、蛹重、卵孵化率等外在方面，也与其自身的中肠消化酶活力、营养效应等息息相关[1-3]。因此，深入探究昆虫对食料的嗜食性和适应程度，对于控制昆虫种群兴衰具有重要作用[4]。【前人研究进展】目前，通常将采集到的昆虫在实验室条件下采用人工饲料饲育以进行不同类型的研究。在昆虫的人工饮食中添食抗生素、维生素以及一些激素类等添加物是实验室昆虫饲育及生物学研究的关键组成部分[5-9]。有研究表明，在家蚕的人工饲料中添食KI、BCH(蚕促9号)、糖类物质以及L-酪氨酸等有利于提高家蚕的全茧量、蛹重以及解舒率等[10-13]，这对于家蚕的的生长发育具有正向效应。此外，另有相关研究表明，微生物也可作为饲料添加剂应用到动物等饲育中。例如，恩普尔NM-I原液微生态制剂(含枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌等菌种)作为理想的抗生素替代品[14]，被广泛用作于动物饲料添加剂。而将其发酵液添食昆虫后，对家蚕等昆虫生长发育也具有一定促进作用[14]。最近，也有相关研究显示出添食枯草芽孢杆菌虽对家蚕生长发育具有一定正向效应，但在家蚕茧层率等方面呈现出负向效应[15]。芽孢杆菌属等作为家蚕、斜纹夜蛾等鳞翅目昆虫肠道的定植菌属，对宿主发育、营养和生理等诸多方面产生重要影响。昆虫肠道微生物作为昆虫与微生物在长期进化过程中形成的虫菌共生体系中的重要组成部分，可以分泌多种消化酶，在昆虫营养消化吸收等方面发挥着直接或间接的作用，尤其是在农业生态调控等方面，其与宿主在免疫、代谢、发育等方面的相互作用，是很好的研究模型[16]。枯草芽孢杆菌作为芽孢杆菌属的一种，具有很强的耐逆性，是微生物中可百分之百直达肠道的活菌。同时，枯草芽孢杆菌还具有较好的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及纤维素酶活性，可以帮助宿主更好的利用营养物质[17]。【本研究切入点】枯草芽孢杆菌目前虽已被广泛用作于动物饲料添加剂，但是在实验室昆虫饲育以及昆虫生物学研究等方面涉足较少。【拟解决的关键问题】本试验通过制备不同含菌量人工饲料对斜纹夜蛾初孵幼虫进行饲育，直至化蛹，研究斜纹夜蛾以不同含菌量人工饲料进行饲育对其营养消化、中肠消化酶活性、生长发育等指标的影响。此研究为下一步实验室昆虫饲育以及生物防治等方面奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试虫源。斜纹夜蛾幼虫由华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室提供，并在人工气候培养箱[T(26±2)℃、RH(80±5)%、14L:10D]内采用人工饲料进行连续多代培养，幼虫期每天更换新鲜饲料，并对养虫盒进行清洁消毒处理。成虫放入内表面贴有硫酸纸的10L透明塑料桶中进行交配产卵，并在桶底部放置10%蜂蜜水给予成虫取食。选择健康及发育一致的初孵幼虫进行试验。

供试菌种。供试枯草芽孢杆菌由华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室提供并保存。

1.2 含枯草芽孢杆菌人工饲料配制

斜纹夜蛾人工饲料的配制在朱丽梅[18]等人饲养方法的基础上稍作修改，并加入枯草芽孢杆菌菌悬液配制成菌落数量分别为6×108，6×106和6×104cfu/g的含菌饲料，以不含菌的人工饲料作为对照(CK)。

1.3 幼虫营养指标测定

分别从以不同含菌量人工饲料饲养的斜纹夜蛾幼虫中选取刚蜕皮进入四龄且健康发育一致的幼虫，并饥饿过夜：分别从不同含菌量(含对照组)人工饲料饲养的斜纹夜蛾幼虫中各选取10头称取鲜重，并在80 ℃烘箱中烘干至恒重，测定其干湿比；再分别各选取10头幼虫并称取幼虫鲜重，根据所测幼虫干湿比推测出试前幼虫干重(C)，然后分别饲以不同含菌量(含对照组)的人工饲料，48 h后分别取出残余饲料和粪便，并将试虫和粪便在80 ℃条件下烘干至恒重，以此测得试后粪便干重(E)和幼虫干重(D)；基于以上同样方法，可以测得试前(A)和试后(B)不同含菌量饲料干重。

营养指标的测定参照朱俊洪[19]：

每处理用虫20头，重复3次。

1.4 幼虫中肠消化酶活性测定

1.4.1 中肠粗酶液的制备 分别选取发育一致且经饥饿过夜处理后的待测幼虫，每20头为一次重复，共3次重复，在超净台上将幼虫体表进行消毒漂洗后于冰浴中迅速解剖。然后用预冷的相应酶缓冲液冲洗去幼虫肠道外表面体液，用无菌解剖剪，剪取幼虫中肠，将其置于预加有5 mL预冷相应酶缓冲液的玻璃匀浆器迅速匀浆。最后将匀浆液等量分装于1.5 mL离心管中并置于高速冷冻离心机上4 ℃，10 000 r/min,离心10 min。离心后取上清液即为粗酶液。

1.4.2 淀粉酶 取200 μL 2%淀粉, 800 μL 0.2 mol/L PBS(pH6.0)，800 μL酶液,室温下反应10 min后，置于37 ℃水浴60 min，加1 mL 3,5-二硝基水杨酸终止反应，然后沸水浴5 min，于550 nm波长测吸光值。无酶反应体系用0.2 mol/L PBS(pH6.0)代替酶液，作为对照(CK)。每处理3次重复，取平均值。

1.4.3 海藻糖酶 取200 μL 3%海藻糖, 800 μL 0.2 mol/L PBS(pH 5.8)，800 μL酶液,室温下反应10 min后，置于37 ℃水浴60 min，加1 mL 3,5-二硝基水杨酸终止反应，然后沸水浴5 min，于550 nm波长测吸光值。无酶反应体系用0.2 mol/L PBS(pH 5.8)代替酶液，作为对照(CK)。每处理3次重复，取平均值。

1.4.4 蔗糖酶 取200 μL 4%蔗糖, 800 μL 0.2 mol/L PBS(pH 5.8)，800 μL酶液,室温下反应10 min后，置于37 ℃水浴60 min，加1 mL 3,5-二硝基水杨酸终止反应，然后沸水浴5 min，于550 nm波长测吸光值。无酶反应体系用0.2 mol/L PBS(pH 5.8)代替酶液，作为对照(CK)。每处理3次重复，取平均值。

1.5 斜纹夜蛾生长发育的测定

选取健康且生长发育一致的初孵幼虫，分别用不同含菌量的人工饲料进行饲养，每处理20头，3次重复。羽化后，雌雄按1∶1配对进行交配产卵，并在交配桶中放置10%蜂蜜水给予营养补充。每天按时进行观察、饲养，记录斜纹夜蛾不同虫态发育历期、蛹重以及产卵量等。

1.6 数据处理

采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，并利用Duncan’s新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同含菌量人工饲料对4龄幼虫的营养效应

从表1可以看出，取食不同含菌量人工饲料幼虫相对取食率依次为CK组>6×104cfu/g组>6×108cfu/g组>6×106cfu/g组，且取食含菌量人工饲料6×106cfu/g组显著低于其余各组；取食不同含菌量人工饲料幼虫食物转化率和食物利用率分别依次为6×106cfu/g组>CK组>6×104cfu/g组>6×108cfu/g组，且取食含菌量人工饲料6×106cfu/g组显著高于其余各组；取食不同含菌量人工饲料幼虫相对生长率和近似消化率分别依次为CK组>6×106cfu/g组>6×104cfu/g组>6×108cfu/g组，且取食含菌量人工饲料6×108cfu/g组显著低于其余各组，同时其余各组之间不存在显著性差异。

表1 不同含菌量人工饲料对4龄幼虫的营养效应

从表2可以看出，取食不同含菌量人工饲料幼虫平均鲜重依次为6×106cfu/g组>6×108cfu/g组>6×104cfu/g组>CK组，且取食含菌量人工饲料6×106cfu/g组4龄幼虫平均鲜重显著高于其余各组。

表2 不同含菌量人工饲料对4龄幼虫均重的影响

2.2 不同含菌量人工饲料对幼虫中肠消化酶活性的影响

从表3可以看出，不同含菌量人工饲料对斜纹夜蛾不同虫龄幼虫中肠消化酶活性的影响有所不同。取食不同含菌量人工饲料2龄幼虫淀粉酶活力依次为6×104cfu/g组>6×106cfu/g组>CK组>6×108cfu/g组，且取食含菌量人工饲料6×104cfu/g组和6×106cfu/g组显著高于其余各组；取食不同含菌量人工饲料2龄幼虫海藻糖酶活力依次为6×104cfu/g组>6×106cfu/g组>CK组≥6×108cfu/g组，且取食含菌量人工饲料6×106cfu/g组与其余各组之间均不存在显著性差异；取食不同含菌量人工饲料2龄幼虫蔗糖酶活力依次为6×106cfu/g组>6×104cfu/g组>6×108cfu/g组>CK组，且取食含菌量人工饲料6×104和6×106cfu/g组显著高于CK组；取食不同含菌量人工饲料4龄幼虫淀粉酶活力依次为6×104cfu/g组>6×108cfu/g组>6×106cfu/g组>CK组，且取食含菌量人工饲料6×104cfu/g组淀粉酶活显著高于其余各组；取食不同含菌量人工饲料4龄幼虫海藻糖酶活力依次为6×104cfu/g组>6×106cfu/g组>6×108cfu/g组>CK组，且取食3种不同含菌量人工饲料幼虫海藻糖酶活力均显著高于CK组；取食不同含菌量人工饲料4龄幼虫蔗糖酶活力依次为6×108cfu/g组>6×106cfu/g组>6×104cfu/g组>CK组，且取食含菌量人工饲料6×108cfu/g组蔗糖酶活力显著高于CK组。

表3 不同含菌量人工饲料对幼虫中肠消化酶活性的影响

2.3 不同含菌量人工饲料对斜纹夜蛾生长发育的影响

2.3.1 不同含菌量人工饲料对斜纹夜蛾发育历期的影响 从表4可以看出，取食不同单位饲料含菌量人工饲料的斜纹夜蛾幼虫历期依次为CK组>6×106组>6×108组>6×104组；蛹历期依次为6×104组>6×106组>CK组>6×108组；成虫历期依次为6×104组>6×108组>6×106组>CK组；卵历期依次为6×104组>CK组>6×108组>6×106组；世代总历期依次为6×104组>6×108组>6×106组>CK组；表明，6×104组斜纹夜蛾发育历期最长，6×106以及6×108组次之，CK组斜纹夜蛾发育历期最短；其中，在幼虫和蛹历期，6×108、6×106以及6×104组这3组与对照相比均无显著差异；在成虫历期，6×104和6×108组成虫历期均与对照相比均存在显著性差异，而6×106组与对照相比却未表现出显著性差异；在卵历期，仅6×106组与对照相比均存在显著性差异；在世代总历期，仅6×104组与对照相比表现出显著差异。

表4 不同含菌量人工饲料对斜纹夜蛾发育历期的影响

2.3.2 不同含菌量人工饲料对斜纹夜蛾蛹及卵的影响 从表5可以看出，在喂食不同含菌量人工饲料对斜纹夜蛾蛹的影响方面，其化蛹率、雌雄比(雌/雄)以及蛹羽化率各组之间均达到显著性差异；在蛹重方面，6×104、6×106组这2组雌蛹重均与对照相比达到显著性差异，而6×108组与对照相比却未表现出显著性差异；在雄蛹重方面，仅6×106组与对照相比达到显著性差异，其余各组之间差异不明显；在喂食不同含菌量人工饲料对斜纹夜蛾卵的影响方面，6×108、6×106以及6×104组这3组单雌产卵量与对照相比均表现出显著性差异，其中6×108、6×106组这2组之间单雌产卵量差异不明显；在卵孵化率方面，6×104组与其余各组之间均达到显著性差异，而6×108组、6×106以及CK组这3组之间在卵孵化率方面未表现出明显差异。

表5 不同含菌量人工饲料对斜纹夜蛾蛹及卵的影响

3 讨 论

研究结果表明，喂食不同含菌量人工饲料以CK组饲育的幼虫化蛹率以及蛹羽化率最低，虫/蛹重最轻，单雌产卵量最小；而以6×106组饲育的幼虫化蛹率以及蛹羽化率最高，虫/蛹重最重，单雌产卵量最大。同时，以6×106组饲育的幼虫在世代总历期上与CK组饲育的幼虫无显著差异。因此，取食单位饲料含菌量为6×106cfu/g的人工饲料可能最适宜斜纹夜蛾生长发育，而在取食单位饲料含菌量分别为6×108、6×104cfu/g的人工饲料时，对斜纹夜蛾生长发育也有相对较好的促进作用，且在化蛹率、羽化率以及产卵量等方面优于以CK组饲育的。

枯草芽孢杆菌作为微生物中可百分之百直达肠道并定植的活菌，可参与昆虫肠道菌群动态平衡调节，而肠道菌群对昆虫的营养效应是极为重要的因素[20-21]。某些昆虫肠道微生物(例如：从斜纹夜蛾幼虫肠道分离出的甲基营养菌等)有助于其体内消化酶的产生[22-24]。昆虫肠道海藻糖酶、蔗糖酶等消化酶活力的增加在一定程度上可提高摄取食物转化为昆虫生物量的效率[5]，而食物转化率等营养指标在一定程度上反映了昆虫对宿主的喜食利用以及自身发育优劣程度[4,25]。本研究发现，喂食不同含菌量人工饲料以6×106组饲料饲育的幼虫相对取食率显著低于其余各组；而在食物转化率和食物利用率方面，以6×106组饲料饲育的幼虫却均显著高于其余各组。由此推断，斜纹夜蛾幼虫这种较高的食物转化率和食物利用率可能是对其低取食量的一种生理补偿的结果[26]，同时，在其取食量显著低于其他组的情况下，仍能有较高的生物量(即幼虫重)，说明斜纹夜蛾幼虫可以高效地将食物转化为虫体组织[27]。此外，蛹重作为衡量幼虫期营养质量的重要指标，可以从侧面反映出斜纹夜蛾幼虫期生长发育质量。研究发现，以6×106组饲料饲育的幼虫化蛹后相较于其余各组无论雌/雄蛹均具有较高的蛹重，表明斜纹夜蛾幼虫取食单位饲料含菌量为6×106cfu/g人工饲料可获得较好的营养质量。因此，单位饲料含菌量为6×106cfu/g人工饲料对斜纹夜蛾幼虫可能有较好的取食适合度。在幼虫相对生长率和近似消化率方面，喂食不同含菌量人工饲料的幼虫之间总体差异不明显，导致这一现象的原因可能与其体内消化酶活性有关[4]。以6×106组饲料饲育的幼虫虽然具有较高的相对生长率、食物转化率和食物利用率，但其却没有表现出较高的海藻糖酶、蔗糖酶等消化酶活性；这可能与其自身肠道微生物变化以及机体生长补偿机制有关，具体原因有待进一步探究。

研究发现，斜纹夜蛾4龄幼虫中肠消化酶活力要高于2龄幼虫，这可能与其自身食量增加有关；同时，斜纹夜蛾幼虫取食不同含菌量人工饲料均能正常完成生活世代。相较于对照组(CK)，取食不同含菌量人工饲料对斜纹夜蛾生长发育以及消化酶活性均具有较好的促进作用，但对其世代总历期具有一定延滞效应。此外，取食单位饲料含菌量为6×106和6×108cfu/g组饲料均可显著降低斜纹夜蛾雌雄比(雌/雄)，其中以取食单位饲料含菌量为6×106cfu/g组最佳[其雌雄比(雌/雄)为0.77]。因此，下一步对取食单位饲料含菌量为6×106cfu/g人工饲料的幼虫机体补偿机制以及导致其低雌雄比的原因进行深入探究分析，这将为之后实验室昆虫饲育以及病虫生物防治等方面提供重要理论指导。

4 结 论

斜纹夜蛾幼虫取食单位饲料含菌量为6×106cfu/g人工饲料对其生长发育及中肠酶活力等具有明显的促进作用，因此单位饲料含菌量为6×106cfu/g人工饲料对斜纹夜蛾幼虫具有较好的取食适合度。