青海省小麦种质资源抗条锈鉴定和抗病基因筛选

张小娟，侯万伟

(1.青海大学生态环境工程学院, 省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室, 青海 西宁 810016；2.青海大学农林科学院, 青海 西宁 810016)

【研究意义】小麦条锈病是由小麦条锈菌引起的世界性小麦病害之一，该病害喜低温和冷凉环境下，且在小麦的整个生育期均可被感染。该病菌可通过气流高空远距离传播，随降雨或结露侵染小麦引发病害，具有突发性强，发病范围广，流行频率高，危害严重，损失惨重，传染速度快等特点[1]。化学农药的大面积使用可有效控制小麦条锈病的蔓延，但是耗时耗力，且对生态环境会造成一定的污染[2]。实践证明，选育和利用抗病品种是防治小麦条锈病最有效、经济、安全的措施[3-5]。由于小麦条锈菌群体毒性结构复杂且易变异，自然状态下新的毒性小种不断形成，同种抗病基因使用时间过长易导致抗病基因“丧失”抗病性，使小麦群体抗病遗传多样性变低，最终使得小麦条锈病呈周期性流行。对于怎样有效且高效解决抗病性“丧失”这一大世界难题，有关的专家学者利用慢锈性[6]，持久抗性[7]等，其主要目的是丰富抗病基因种类和对其合理实施布局。【前人研究进展】目前已经命名的抗条锈病基因有80多个(Yr1～Yr80)和很多暂命名的基因[8-9]。这些已公布的小麦抗条锈病基因主要有为小种专化的全生育期抗性基因，少部分是成株期抗性基因或高温成株期抗性基因。前期为选育和利用抗病基因，董淑静等[10]对河南的43个品种进行了抗条锈病基因的分子检测；周新力等[11]对国外春小麦的80份种质资源的小麦抗条锈性病做了分子鉴定；万江华等[12]对108份小麦品种抗条锈病基因进行分子标记检测；韩德俊等[13]对1980份小麦地方品种和国外种质进行了抗病性鉴定；袁飞敏等[14]对197份青海小麦品种(系)进行了抗病性基因分子鉴定。青海省是我国小麦条锈菌的主要越夏流行区之一，每年拥有大量的小麦条锈病越夏菌源，主要以晚熟春小麦为主。由于青海省内种植的春小麦主要以感病品种阿勃为主，这为我国小麦条锈病越夏菌源区的区域治理造成非常不利的局面。不断发掘新的抗条锈病基因并合理利用是青海省抗病育种的重要基础，是抑制我国小麦条锈病菌越夏的重要手段。因此本研究拟利用对当前条锈菌流行小种CYR32、CYR33、CYR34对95份青海省小麦品种进行苗期、成株期抗病性鉴定，综合衡量其抗病性。同时利用已有的分子标记(Yr5、Yr9、Yr10、Yrl5、Yr17、Yr18和Yr26)进行分子检测，并结合系谱分析推测可能的抗条锈病基因。【本研究切入点】青海省的小麦主栽品种将对不断产生的变异的毒性小种没有抗病性或丧失一定的抗病性最终导致小麦粮食产量下降，青海也面临抗病基因抗性“丧失”的问题。【拟解决的关键问题】本研究通过青海省当地小麦品种抗病性鉴定及分子检测，分析其可能的抗病基因，同时研究及分析青海省主要种植区的小麦品种抗条锈病基因的(或抗源)分布利用现状，从而挖掘出新的抗病基因或实现抗病基因的聚合。此研究为青海省抗条锈病基因的合理利用、小麦品种合理布局和品种推广有着重要意义。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 小麦材料 参试95份小麦种质材料，均由青海省农林科学院种子库提供。

1.1.2 条锈菌流行小种 供试的条锈菌生理小种CYR32、CYR33 和 CYR34，均为近些年我国的流行生理小种均由西北农林科技大学小麦条锈病研究实验室提供，经单胞分离并由鉴别寄主鉴别后，单胞菌系扩繁获得。

1.2 试验方法

1.2.1 抗条锈病鉴定苗期鉴定 在温室条件下进行，待小麦生长至二叶完全展开，采用抖粉法接种。约 15 d开始调查其反应型。反应型的读取参考Line 和 Qayoum[15]的9级判定标准。依据划分标准，划分抗病类型为0～6 级，感病类型为7～9。成株期抗条锈病鉴定与2019、2020年采用混合小种接种鉴定。其中，2019年接种混合小种1∶1(CYR32∶CYR33)，2020年接种混合小种 1∶1(CYR32∶CYR34)。反应型按照国际标准，分为9个等级：0～3 为抗病(R)、4～6为中抗(MR)、7为中感病(MS)、8～9为感病(S)，病情严重度，按照 0、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和 100%的13级标准记载。

1.2.2 DNA提取 表型调查结束后，采取小麦叶片剪碎置于2 mL离心管中，一份置于-80 ℃保存备用，另一份用于DNA的提取。DNA 的提取采用DS方法[16-17]，并略作调整。

1.2.3 抗病基因分子检测 经过抗病性的鉴定和筛选，参照文献，选择Yr5[18]、Yr9[19]、Yr10[20]、Yr17[21]、Yr15[22]、Yr18[23]、Yr26[24]等抗病基因稳定的分子标记(表1)，引物送上海生工合成。PCR扩增体系为15 μL，其中2×EsTaqMasterMix(Dye)7.5 μL，正反向引物各1 μL，模板DNA 1.5 μL。PCR扩增及电泳参照各个抗病基因的文献。

表1 相关基因的分子标记

2 结果与分析

2.1 抗病性鉴定

表2显示，利用当前条锈病流行小种 CYR32 和CYR33 及 CYR34对供试95 个青海省小麦品种(系)进行苗期、成株期抗病性鉴定。苗期抗条锈性结果显示：10份(11%)供试品种(系)对小种 CYR32 表现为免疫；其余85份(89%)表现为高抗；44 份(46%)参试品种(系)对小种 CYR33 表现为免疫，其余50份(53%)表现为高抗，1份(1%)表现为中抗；其中3份(3%)参试品种(系)对小种 CYR34 表现为免疫，11份(12%)参试品种(系)对小种 CYR34表现为抗病，81份(85%)表现为感病。在参试品种(系)中有 12 份(13%)材料对 CYR32、CYR33 和 CYR34 同时表现抗病，分别为互助红、高原602、宁春4号、吉农469、民和853、青春37、宁春26、高原205、民和665、山旱901、互助13号、高原466。

表2 小麦抗条锈病性鉴定

成株期抗条锈性结果显示：2020年相比于2019年，12份小麦品种(13%)抗病性增强；8份(8%)材料仍保持抗性，但抗性在逐渐减弱；74份材料(78%)抗病性在减弱，从抗病逐渐演变为感病。

2.2 分子检测结果

2.2.1Yr5基因分子检测 利用STS7/8标记对所有供试小麦品种进行检测，结果显示含有Yr5基因小麦品种中PCR可扩增出一条约 100 bp 的条带，在不含该抗性基因的小麦品则没有该条带(图1，表3)，所有供试的青海省小麦材料中共有74份小麦品种检测到有Yr5基因占总参试材料的78%(图8)。

1：高原776；2：高原115；3：吉农469；4：墨引1号；5：阿勃；6：高原338；7：乐麦6号；8：张春811；9：曹选5号；10：40-8；11：新麦繁4；12：兰考906；13：林农20

2.2.2Yr9基因分子检测 利用引物H20F/R检测小麦品种Yr9基因，含有Yr9基因小麦品种中可扩增出一条约 1600 bp 的条带，不含该抗性基因的小麦品种中则没有该条带(图2，表3)，有16份材料检测到含有Yr9基因占总参试材料的17%(图8)。

M：DL2000；1：高原158；2：高原506；3：铁普麦；4：ME-45；5：普冰133；6：杨麦16号；7：蓝天选系；8：青春41；9：13繁516-2；10：13796；11：13799；12：13繁530；13：青春533；14：青紫1号；15：兰天15

2.2.3Yr10基因分子检测 利用引物 Yr10F/R 对Yr10基因进行检测，含有Yr10基因小麦品种中可扩增出相应条带，不含该抗性基因的材料则没有扩增出该条带(图3，表3)，95份材料有 50份材料可能含有Yr10基因占总参试材料的53%(图8)。

M：DL2000；1：青春415；2：高原466；3：柴春044；4：新哲9号；5：高原V028；6：互麦13号；7：烟福188；8：青春524；9：高原175；10：柴春901；11：青春570:；12：互麦15号；13：山早901；14：兰天3号；15：高原448

2.2.4Yr15基因分子检测 利用引物 Xbarc8检测Yr15抗性基因，含有该基因品种能扩增出约 180 bp 的条带，不含有该基因品种没有扩增出条带(图4，表3)，含有Yr15材料有 72份占总参试材料的76%(图8)。

M：DL2000；1：高原158；2：高原506；3：铁普麦；4：ME-45；6：普冰133；7：杨麦16号；8：蓝天选系；9：青春41；10：13繁516-2；11；13796；12:13799；13:13繁530；14：青春533；15：青紫1号；

2.2.5Yr17基因分子检测 利用引物 VENTRIUP/LN2检测Yr17，含有该基因的材料中可扩增出条带，不含该基因的小麦品种中未扩增出条带(图5，表3)，本研究所用的小麦品种(系)中检测到含有Yr17抗性基因的材料有74份占本研究材料的78%(图8)。

M：DL2000；1：乐麦5号；2：高原776；3：高原115；4：吉农469；5：墨引1号；6：阿勃；7：高原338；8：乐麦6号；9：张春811；10：曹选5号；11：40-8；12：新麦繁4；13：兰考906；14：林农20号

2.2.6Yr18基因分子检测 利用引物对 SLV34F/R检测Yr18，含有该基因的材料中可扩增出条带一条248 bp条带，不含该基因的小麦品种中未扩增出条带(图6，表3)，本研究所用的小麦品种(系)中检测到含有Yr18抗性基因的材料有69份占95份材料的73%(图8)。

M：DL2000；1：青春415；2：高原466；3：柴春044；4：新哲9号；5：高原V028；6：互麦13号；7：烟福188；8：青春524；9：高原175；10：柴春901；11：青春570

M：DL2000；1:高原158；2：高原506；3：铁普麦；4：ME-45；6：普冰133；7：杨麦16号；8：蓝天选系；9：青春41；10：13繁516-2；11；13796；12：13799；13：13繁530；14：青春533；15：青紫1号

图8 95份小麦品种抗病基因分布图

2.2.7Yr26基因分子检测 利用引物WE173检测Yr26基因，检测结果表明，携带Yr26基因的品种可以扩增出一条约 480和750 bp大小的条带，不含该抗性基因的品种中未扩增出条带(图7，表3)，95份小麦品种77份材料检测到含有Yr26基因占该实验材料的81%。

表3 青海省95个小麦品种Yr基因的分子检测

3 讨 论

本研究通过对来自青海省95份种质资源经过苗期抗条锈病鉴定和分子检测方法筛选抗病基因，实现目前青海省小麦品种的抗条锈性评价及明确抗病基因分布情况，对于控制青海省小麦条锈病流行和抑制我国小麦条锈病菌越夏具有重要意义。

苗期抗病性检测用当前条锈病流行小种 CYR32、CYR33、CYR34对供试95 个青海省小麦品种(系)进行苗期抗病性鉴定发现，多数小麦品种含有Yr26基因，对CYR32和CYR33两个小种都有抗病性且抗性极强，而对CYR34基本没有抗性，大多品种表现极易感染；含有Yr9基因的大多品种对3个毒性小种均有抗性且抗性强；前人研究发现Yr5、Yr9、Yr10、Yr17、Yr26具有全生育期抗性且Yr18苗期无抗性而在成株期具有抗性，进一步验证本研究结果。新的毒性小种CYR34的出现导致含Yr26基因的品种抗病性丧失，而当品种中携带Yr9基因时，该品种对CYR34仍保持抗性。成株期抗条锈性鉴定表明，由于新的毒性小种CYR34的出现导致少部分小麦品种抗病性增强，极少部分材料仍保持抗性，但抗性在逐渐减弱，大部分小麦品种抗病性在减弱，从抗病逐渐演变为感病。

分子检测结果表明青海省小麦品种对抗病基因Yr5、Yr10、Yr15、Yr17、Yr18、Yr26使用频繁，尤其是抗病基因Yr26基因多次使用，在参试品种中所占比例较大，之前已有我国研究人员对抗条锈基因Yr26做了相关研究，发现Yr26对 CYR32、CYR33 两个毒性小种均表现为高抗或免疫反应[25]，从而使得含Yr26基因的小麦品种得到了大面积的推广。但是因为对Yr26基因的过度依赖，导致新的毒性小种 CYR34出现的情况下，大部分小麦品种均“丧失”抗性[26]。本研究中共16份材料含有抗病基因Yr9和其他未知抗病性基因，使用相对较少，可在后期推广应用，但是为了避免该基因长期使用后丧失其抗病优势，可采用多基因组合等方式避免抗病性丧失[27]。

4 结 论

抗病性鉴定结果表明，10份供试品种(系)对小种 CYR32 表现为免疫；其余85份表现为高抗；44 份参试品种(系)对小种 CYR33 表现为免疫，其余51份表现为高抗或中抗；其中3份参试品种(系)对小种 CYR34 表现为免疫，11份参试品种(系)表现为抗病，81份表现为感病。在参试品种(系)中有 12 份材料对 CYR32、CYR33 和 CYR34 同时表现抗病。成株期抗条锈性结果显示：2020年相比于2019年，12份小麦品种(13%)抗病性增强；8份(8%)材料仍保持抗性。分子检测结果显示，Yr5、Yr10、Yr15、Yr17、Yr18、Yr26使用频繁，需在后期加大基因的合理布局。