寒地粳稻抗旱性鉴定指标筛选及综合评价

李红宇，夏玉莹，刘梦红，郑桂萍

(1.黑龙江八一农垦大学 农学院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学 黑龙江省现代农业栽培技术与作物种质改良重点实验室，黑龙江 大庆 163319)

【研究意义】水稻为我国65%以上的人口提供主食，对保障国家粮食安全起到重要作用。中国淡水资源匮乏，且时空分布及其不均匀。水稻是耗水量最大的粮食作物，近年区域性旱灾加重对水稻影响逐渐加剧[1]，目前我国超过65%的稻田受到干旱的影响[2]。因此，比较不同基因型水稻抗旱的表型特征、生理生化机制，建立抗旱性评价指标体系，筛选抗旱种质资源，对水稻抗旱育种及提高水分利用效率具有重要意义。【前人研究进展】水稻抗旱性是多因素相互作用构成的复杂系统，包括形态抗性、生理生化抗性及生长发育进程的改变等，其鉴定结果受生育时期、鉴定指标、评价方法等诸多因素的限制，单一或少数指标很难准确评价，应该运用多种指标综合评价[3]。如发芽期抗旱性鉴定主要是利用聚乙二醇、甘露醇等高渗溶液模拟水分胁迫，常用筛选指标有发芽率、发芽势、胚芽长、主胚根长、胚芽鞘长、胚芽干重、胚根干重等[4-5]；苗期一般在培养箱、温室或大田中人为控水，采用国际水稻所抗旱鉴定标准对胁迫后的卷叶、枯叶及干旱恢复情况进行分级评价，或以根长、根数、根重、根冠比、根系相对含水量、植株干鲜重等为指标进行综合评价[3,6]；生育中后期鉴定一般在降雨极少的区域或设有防雨设施的大田进行，在主要生育时期给予不同程度干旱胁迫，测定形态[7-8]、生理生化[9-10]、渗透调节物质[11]等，以确定抗旱筛选指标。数据统计分析方面普遍采用综合指标法[12]，即以抗旱系数描述单项指标变异，再结合隶属函数、主成分分析、聚类分析等方法进行综合评价。【本研究的切入点】综合指标法虽然全面考虑了各指标的贡献率大小，但是参试指标间仍然可能存在非线性关系，从而导致利用传统主成分分析进行线性降维会造成评价结果偏差[13]。【拟解决的关键问题】本研究采用一种基于非线性投影的对数主成分评价法，在盆栽条件下对6份苗期抗旱材料和6份苗期敏感材料进行了抗旱力鉴定和评价指标筛选，旨在为水稻抗旱种质资源鉴定与应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料和处理

2018年以出苗至成熟生育日数35 d左右的苗期抗旱和敏感粳稻材料各6份为试验材料。采用盆栽试验，设常规对照与干旱处理，试验在黑龙江八一农垦大学校内进行。对照采用常规水分管理，处理于返青期后开始干旱胁迫处理，返青期以80%以上秧苗早晚叶尖吐水为标志。干旱胁迫处理的方法是返青期排干水，采用负压式土壤湿度计测定土壤水势(将湿度计的陶头插入土表以下10 cm处)，保持全生育期土壤水势在-30～-35 kPa，每份材料常规对照和干旱处理各种植14盆，插秧规格为4穴/盆，4苗/穴。其它管理方法同常规(表1)。

1.2 调查与测定

1.2.1 生物量测定 水稻成熟后各处理分别选取长势均匀的3盆，挖取植株后，去除根系，于105 ℃烘箱中杀青30 min，80 ℃持续烘干至恒重，计算生物量。

1.2.2 光合指标测定 在水稻黄熟期(齐穗后25 d左右)选择天气晴朗的上午9：00-11：00，使用CIRAS-3型便携式光合荧光测定系统测定剑叶净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Ts)、气孔导度(Gs)和胞间CO2浓度(Ci)。

1.2.3 剑叶酶活性的测定 黄熟期(齐穗后25 d左右)每处理取主茎剑叶叶片6片，快速去除叶脉，液氮冷冻，超低温冰箱保存备用。可溶性蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝-250染色法测定[14]；游离脯氨酸含量采用磺基水杨酸法提取，茚三酮显色法进行测定[14]；还原型谷胱甘肽(GSH)含量的提取及测定参照卢少云等[15]的方法。超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)采用任红旭等[16]的方法提取酶液，参照李合生方法[14]进行测定。

1.2.4 茎秆伤流量的测定 于黄熟期(齐穗后25 d左右)每处理选取代表性植株4穴，晚17：00从距地表10 cm处横切10个茎，用已称重(W1)的脱脂棉完全覆盖切口，自封塑料袋包扎以收集根系伤流液，记录时间T1，10 h后记录时间T2。取下包装物并称重，记为W2。利用下式计算齐穗期的单茎根系伤流量。

表1 参试材料名称

单茎根系伤流量(mg/h)=[(W2-W1)/10]/(T2-T1)

(1)

1.2.5 产量及相关性状测定 成熟期调查5盆植株的穴穗数，并依据平均穗数取样6穴，于阴凉通风处风干后，进行理论测产。考察项目包括穗数、穗粒数、结实率、千粒重，计算理论产量。

1.3 数据处理及统计分析

1.3.1 抗旱系数(CDT)CDT(drought tolerant coefficients)=干旱胁迫下指标值/对照指标值

(2)

1.3.2 原始数据无量纲化和对数化

Xi=∑xij/n(i=1,2,…,17)

(3)

对Xi进行对数化处理，得lnXi(i=1, 2, …, 17)。

1.3.3 指标的权重分配 对lnXi进行主成分分析，依据特征值大于1或者累计方差贡献率大于80%的原则确定主成分个数。根据主成分载荷矩阵计算lnXi的权重和主成分：

(4)

其中，eij表示第i个指标在第j主成分中的特征向量值，λj表示第j个主成分的特征值。

Pj=lij×lnXi(i=1，2，…，17，j=1，2，…，k)

(5)

1.3.4 主成分Pj权重(Wj)和主成分综合得分(Sf)

(6)

(7)

对公式(6)左右两项同时取指数得到Sf。

(8)

1.3.5 统计分析软件 利用Excel 2019进行描述性分析、主成分权重和综合得分计算，利用DPS v 9.50进行相关分析、主成分分析、聚类分析和灰色关联度分析。

2 结果与分析

2.1 各单项指标的抗旱系数及相关分析

对17项参试指标的处理间差异进行成组数据t测验，除SPAD、可溶性蛋白含量(SP)、超氧化物歧化酶(SOD)、游离脯氨酸含量(Pro)、还原型谷胱甘肽含量(GSH)外，其它指标处理与对照差异显著或极显著(表2)。根据公式(2)计算每个单项指标的抗旱系数(CDT)，以消除基因型间的本底差异及指标间的量纲差异。水分胁迫条件下各参试材料17个性状抗旱系数的平均值为0.727，分布区间为0.175～1.238，95%置信度为0.159。从变异系数方面看，变异系数最大为伤流量(138.511%)，SPAD(85.967%)次之，过氧化物酶活性(51.630%)再次之；变异系数最小为千粒重(6.184%)，气孔导度次之(9.939%)，净光合速率再次之(10.947%)。干旱胁迫后，各品种的穗数、穗粒数、结实率、千粒重、产量、伤流量、干物质量、SPAD、净光合速率、蒸腾速率、胞间隙CO2浓度、气孔导度均下降(CDT<1)，部分品种的可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性、游离脯氨酸含量、还原型谷胱甘肽含量升高(CDT>1)。

表2 干旱胁迫下各单项指标的t值及抗旱系数

2.2 参试材料抗旱性的主成分分析

主成分分析可在损失较少信息量的前提下，将多指标简化为少量综合指标，以浓缩数据、简化指标，弥补利用单项指标评价抗旱性的不足[19]。主成分数目的确定应同时满足数据降维和信息综合的要求。一般主成分累计贡献率大于80%或85%即可认为信息具有代表性。表3结果表明，前5个主成分的特征值均大于1，贡献率分别为36.125%、15.797%、14.601%、10.797%和6.896%，其累计贡献率达到84.215%，即前5个相互独立的主成分代表了17个指标84.215%的变异信息，其余可忽略不计。这5个主成分分别命名为：PC1，PC2，PC3，PC4，PC5，PC6。

表3 主成分特征值与方差贡献率

第一主成分(PC1)的贡献率为36.125%(表4)，该主成分中胞间隙CO2浓度(0.368)、蒸腾速率(0.339)、气孔导度(0.344)、可溶性蛋白含量(0.335)、SPAD(0.327)、超氧化物歧化酶(0.305)等6个指标的载荷较高，可以主成分载荷绝对值最高的胞间隙CO2浓度为代表，称为胞间隙CO2浓度因子；第二主成分(PC2)的贡献率为15.797%，该主成分载荷绝对值以还原型谷胱甘肽含量(0.393)最高、过氧化物酶(0.378)和伤流量(0.376)次之，可称为还原型谷胱甘肽含量因子；第三主成分(PC3)的贡献率为14.601%，该主成分载荷绝对值以穗数(0.450)和净光合速率(0.459)较高，可称为穗数和净光合速率因子；第四主成分(PC4)的贡献率为10.797%，该主成分载荷绝对值以千粒重(0.513)和游离脯氨酸含量(0.510)较高，可称为千粒重和游离脯氨酸含量因子；第五主成分(PC5)的贡献率为6.896%，该主成分载荷绝对值以结实率(0.356)最高，故称为结实率因子。

依据公式(4)计算lnXi的权重lij(表4)，代入公式(5)可得5个主成分的解析式：

表4 主成分因子载荷矩阵及lnXi权重

P1=-0.01lnX1+ 0.096lnX2+ 0.095lnX3-0.023lnX4+ 0.113lnX5+ 0.017lnX6-0.071lnX7+ 0.081lnX8+ 0.137lnX9+ 0.148lnX10+ 0.139lnX11+ 0.132lnX12+ 0.135lnX13+ 0.123lnX14-0.078lnX15-0.034lnX16+ 0.034lnX17

(9)

P2=-0.055lnX1-0.06lnX2-0.172lnX3+ 0.219lnX4-0.134lnX5+ 0.229lnX6+ 0.196lnX7+0.049lnX8+ 0.07lnX9+0.05lnX10-0.031lnX11-0.092lnX12+ 0.085lnX13+0.205lnX14-0.231lnX15-0.016lnX16-0.24lnX17

(10)

P3=-0.285lnX1+0.16lnX2-0.042lnX3+0.072lnX4-0.04lnX5+0.16lnX6-0.14lnX7-0.291lnX8+0.12lnX9+ 0.045lnX10-0.067lnX11-0.155lnX12+0.162lnX13+ 0.01lnX14+0.147lnX15+0.207lnX16+0.145lnX17

(11)

P4= 0.245lnX1-0.104lnX2+0.034lnX3+0.379lnX4+0.138lnX5+0.11lnX6-0.309lnX7+0.178lnX8-0.107lnX9-0.122lnX10+0.012lnX11+0.036lnX12+ 0.028lnX13-0.021lnX14-0.016lnX15+0.377lnX16+0.014lnX17

(12)

P5= 0.273lnX1-0.218lnX2-0.328lnX3+0.093lnX4-0.212lnX5-0.37lnX6+0.031lnX7-0.119lnX8+0.252lnX9+0.208lnX10-0.196lnX11+0.091lnX12+ 0.046lnX13+0.158lnX14-0.134lnX15+0.087lnX16+0.459lnX17

(13)

2.3 抗旱性综合评价

将各主成分的特征值代入公式(6)，计算出各主成分的权重(Wj)分别为0.429、0.188、0.173、0.128、0.082，将lij和Wj代入公式(8)计算出抗旱综合评价值Sf。

(14)

各品种平均Sf值为0.743(表5)，分布区间在0.402～1.066，95%置信度为0.099。综合抗旱Sf值排名前3位的材料分别为DPB71(1.066)、莹稻2(0.917)、绥粳21(0.859)。DPB71在游离脯氨酸含量表现为最强的抗旱性，莹稻2和绥粳21在过氧化物酶活性表现为最强的抗旱性。综合抗旱Sf值最小的是绥育146，其在伤流量表现为最弱抗旱性。

表5 参试材料的抗旱性综合评价结果

2.4 不同基因型的抗旱性聚类分析

依据抗旱综合评价Sf值的欧氏距离，采用最长距离法对12个参试材料进行聚类分析，在最长距离大于0.9562处分为3类：强抗旱型、中抗旱型和旱敏感型(图1)。第Ⅰ类包括DPB71和莹稻2，属强抗旱类型；第Ⅲ类仅包括绥育146，属旱敏感型；其余参试材料归入第Ⅱ类，属中抗旱类型。

图1 12个参试材料抗旱能力的系统聚类分析

2.5 水稻抗旱鉴定指标的筛选

为简化鉴定程序，筛选对抗旱综合评价Sf值有显著影响的指标，利用已得到的抗旱综合评价Sf值和性状之间的关系构建回归方程。W检验和D检验均不显著(表6)，说明因变量Sf值符合正态分布，适合进行回归分析。

表6 D值正态检验结果

以Sf值为因变量，各鉴定指标的抗旱系数作为自变量，建立抗旱性评价的逐步回归方程。回归方程为：

Sf=-0.7536-0.3076X1-0.0747X2+ 1.2211X4+ 0.1419X6+ 0.6306X10+ 0.4839X11-0.1324X12-0.0583X15+ 0.0223X16

(15)

式中：X1、X2、X4、X6、X10、X11、X12、X15、X16分别表示穗数、穗粒数、千粒重、伤流量、胞间隙CO2浓度、气孔导度、SPAD、过氧化物酶、游离脯氨酸含量。

Durbin-Watson统计量d=1.99，回归方程的F值为73139.60，P=0.0001。进入方程的自变量与Sf值偏相关均达到极显著水平(表7)。

表7 偏相关分析

对回归方程的估计精度进行评价(表8)，各参试材料的估计精度均在99.91%以上，表明方程拟合很好，进入方程的9个指标对水稻抗旱性有显著影响。方程可用于水稻抗旱性评价，在相同条件下可利用以上9个指标的抗旱系数预测其它品种的抗旱性。

表8 回归方程的估计精度分析

3 讨 论

3.1 关于水稻抗旱性评价指标的筛选

高产和优质是作物育种、栽培的最重要的目标。产量高低是判断作物抗旱性的直接指标，前人在鉴定和评价水稻组合的抗旱能力时，常采用产量抗旱系数和抗旱指数。产量抗旱系数主要反映水稻对干旱的敏感程度，但弱化了作物自身的丰产特性；产量抗旱指数将水稻抗旱性与基因型、生态环境和产量水平联系起来，弥补了抗旱系数的不足，但使用该指标评价抗旱性要求一定资源基数，对少量或单一种质资源进行抗旱性评价时准确性下降。作物的抗旱性是受基因型、环境因子及其互作影响的复杂表型，是多种抗旱机理的综合反映，故单一指标对作物抗旱性的评价结果存在很大局限性和不足[6]。尽管对水稻全生育期抗旱性的筛选和评价中仍然缺乏统一标准，但采用形态、生理、生化等与抗旱性密切相关的多个指标综合反映作物抗旱性已达成共识。如张鸿等[7]采用盆栽试验，利用株高、有效穗数、单穗粒数、单穗实粒数、单穗空壳数、单穗粒重、单穗实粒重、单穗空壳重、结实率、千粒重等10个指标，对10个杂交籼稻新组合的抗旱性进行评价，并筛选出有效穗数、单穗实粒重和结实率等3个杂交籼稻抗旱性综合指标；肖俊青等[17]利用PVC管鉴定法，以最大根长、根干物质重、叶干物质重、根叶长比、分蘖数、叶面积、水分消耗量、水分利用率为鉴定指标，对24份转入抗旱主效基因的水稻材料进行了苗期抗旱特性鉴定，并认为最大根长、根叶长比、分蘖数、水分消耗量适合作为苗期抗旱性鉴定指标。本研究以水稻返青期至成熟期持续干旱为处理，干湿交替灌溉为对照，以抗旱综合评价Sf值为因变量，供试材料各指标的相对值为自变量进行逐步回归分析，建立了水稻抗旱性预测方程：

Sf=-0.7536-0.3076X1-0.0747X2+1.2211X4+0.1419X6+0.6306X10+0.4839X11-0.1324X12-0.0583X15+0.0223X16

(16)

式中：X1、X2、X4、X6、X10、X11、X12、X15、X16分别表示穗数、穗粒数、千粒重、伤流量、胞间隙CO2浓度、气孔导度、SPAD、过氧化物酶、游离脯氨酸含量，可作为北方粳稻抗旱性鉴定的指标。

3.2 关于主成分分析与水稻抗旱性综合评价的关系

主成分分析是将原始数据正交化线性变换到新坐标系统，使数据投影落到不同坐标轴。方差最大者称为第一主成分，其次为第二主成分，依次类推，使数据点在特定向量上的投影方差最大[18-19]。这样就通过数据降维将原来的多个指标转化为少数综合指标(主成分)，并且各综合指标间互不相关。在主成分分析的基础上，计算各试验材料的各主成分的隶属函数值，并依据各主成分的贡献率计算其权重，再利用隶属函数和主成分权重计算试验材料的综合抗旱D值，采用综合抗旱D值评价种质资源抗旱性，较使用隶属函数的评价更为全面和确切[20]。如李海明等[21]以株高、果枝数等12个农艺性状的平均数为基础，采用综合抗旱系数、模糊隶属函数、主成分分析、关联分析和聚类分析相结和的方法，对153份陆地棉种质资源花铃期抗旱性进行了综合评价，划分为强抗旱型、抗旱型、中抗旱型、较敏感型、敏感型，获得强抗旱型材料5份、抗旱型材料35份。吕学莲等[3]采用相似统计分析方法，对120份籼粳杂交衍生系材料的苗期抗旱性进行鉴定，将参试材料分成不抗旱、中等抗旱和抗旱3类，其中抗旱材料10份。但是，上述主成分分析法是线性降维，导致评价指标间及主成分与原始数据间仍可能存在非线性关系，进而导致评价结果的偏差[22]。本研究采用叶明确等[11]提出的对数主成分评价法进行水稻耐旱性的综合评价，以解决指标之间的非线性关系。通过对数主成分分析法将17个指标简化为胞间隙CO2浓度因子、还原型谷胱甘肽含量因子、穗数和净光合速率因子、千粒重和游离脯氨酸含量因子、结实率因子等彼此互不相关的6个主成分，方差累计贡献率达84.215%。在此基础上，结合各指标的lnXi权重及主成分权重，计算抗旱综合评价Sf值。参试材料平均Sf值为0.743，变幅为0.402～1.066，95%置信度为0.099，抗旱性最强的材料为DPB71，最差的材料为绥育146。

4 结 论

通过主成分和隶属函数分析，利用综合抗旱D值对12份参试材料移栽期至成熟期的抗旱性进行综合评价，获得强抗旱种质资源DPB120和DPB71。通过逐步回归分析和相关分析，从25个指标中筛选出二次枝梗数、齐穗期剑叶超氧化物酶活性、齐穗期剑叶过氧化物酶的抗旱系数适宜作为抗旱筛选指标，为寒地水稻种质资源筛选与鉴定，抗旱品种选育提供依据。