分析血清外泌体miRNAs在急性脑梗死诊断中的应用

付坤，刘华强，王健，王法臣，韩良波，王同新

潍坊市益都中心医院神经外一科，山东青州 262500

急性脑梗死（ACI）神经功能性疾病，局部脑组织缺氧缺血是其致病机制，经紧急救治后，仍有45%左右的残疾病死率，对人们有生命威胁，需早诊治早预防[1]。急性脑梗死，诊断方式多样，其中卒中量表评分能对急性脑梗死者神经功能缺损程度进行评估，CT、磁共振成像等能对脑梗死区域做出准确观察，可明确脑血管堵塞情况。但急性脑梗死早期影像学特征不明显，很难将缺血病灶准确地展示出来，而磁共振成像则有使用禁忌，对此，需寻求更敏感的诊断指标，以便抓住ACI者的治疗时机[2]。血清外泌素miRNAs近年得到重视，若存在脑梗死情况，会增加miRNAs表达水平，且此检查无创伤性，便于急性脑梗死者进行重复检测，外泌素miRNAs较高的稳定性，能提高ACI者的诊断准确率[3]。故研究对80例ACI者、80名健康对照者进行观察，旨在评估血清外泌体miR-20b-5p的诊断价值。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

该研究所选病例经过伦理委员会批准。研究所观察的样本是80例ACI者，80名健康对照者，分别归纳为研究组和对照组，研究组：急性脑梗死发病时间6～61 h，平均（34.28±2.91）h；年龄47～72岁，平均（59.63±3.26）岁；男42例，女38例。对照组：年龄46～73岁，平均（60.14±3.59）岁；男43名，女37名。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

纳入标准：研究组：纳入者均与全国第四届脑血管学术会议制度的脑梗死诊断标准相符合，且纳入者均行CT、MRI检测，图像特征和急性脑梗死相同。脑梗死发病时间在72 h内，且为原发性脑梗死；纳入者或家属在同意书上签字。对照组：体检结果均正常。

排除标准：短暂性脑缺血者；有恶性肿瘤者；有其他脑出血疾病者；有脑外伤、感染性疾病者、严重系统性疾病者。

1.2 方法

1.2.1 血清外泌体提取及RNA测定 纳入者均行血清外泌体miRNA提取检测，纳入者均行5 mL静脉血的抽取，在恒温箱中行30 min的放置后，在4℃的冰箱中保存2 min，离心样本后，转移上清液至两个试管中并标记，对样本行二次离心处理，在EP管中放置上清液，保存在－80℃的冰箱中，后在样本中加入63μl溶液，均匀混合后，在4℃的环境中过夜，后对样本行3次离心处理。对样本行醋酸双氧铀水溶液染色处理，对外泌体形态进行观察，后经纳米颗粒跟踪技术对外泌体体积进行相应测定，后经CD9抗体、TSG101抗体、羊抗鼠等对纳入者外泌体蛋白标志物进行检测。各检测措施完成后，根据试剂要求，在冰面上放置提取的外泌体RNA，后经紫外线对其0D260/0D280值进行相应计算，以计算结果对RNA纯度、浓度进行测定。

1.2.2 miRNA检测cDNA扩增处理经All-in-oneTMmiRNA qPCR Ki实施，此过程中反应试剂主要有无RNA酶 水3.6μl、All-in-oneTMmiRNA qPCR Primer2 μl、ROX Reference Dye 0.4μl等，在95℃下对样本行10 min的预变性处理，在完成40个循环后，行10 s的再次变性，后调整温度至60℃，保持20 s后，提高温度至72℃，对其行10 s的延伸处理即可。

1.3 观察指标

观察两组血清外泌体miR-20b-5ps情况。

1.4 统计方法

采用SPSS 24.0统计学软件分析数据，非连续性变量表达方式为中位数和四分位数间距，组间比较采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外泌体观察结果

外泌体以球形结构为特征，直径在100 nm左右；经分离处理后，外泌体体积在98 nm左右，CD63、CD81、CD9为外泌体常见阳性标志物。见图1。

图1 血清外泌体测定结果

2.2 miR-20b-5p相对表达量观察

miR-20b-5p相对表达量在研究组是3.68，1.57～12.48为其四分位数间距，而miR-20b-5p相对表达量在对照组是1.041，0.52～1.81为其四分位数间距，miR-20b-5p相对表达量研究组比对照组高，差异有统计学意义（P＜0.001）。见图2。

图2 两组miR-20b-5p相对表达量

3 讨论

既往临床对外泌体认识不足，被当做是细胞进行废物排泄的工具，然而研究深入后发现，在细胞精密调控下，外泌体才会得到生产和释放。外泌体来源内细胞多泡体，在其形成、转移、释放中参与的蛋白较多，有RAB、ESCRT等，外泌体大小、内容物及表面受体的区别和细胞来源有相关性[4]。经释放后，外泌体在精液、血清等体液中均有分布，且能经血液向全身组织进行转移扩散。在炎症反应、机体损伤等因素下，外泌体会呈聚集性分布，而在卒中模型研究中，可观察到脑缺血病灶会出现强烈摄取外泌体的情况，且持续在缺血区域出现，浓度始终保持在较高水平，若机体健康无损伤，外泌体浓度会呈明显下降趋势[5]。

历年研究发现，经蛋白质、微小核酸核糖等物质，外泌体会对血管形成产生影响，且胶质细胞、神经系统有所改变，在脑梗死重塑过程中有明显的参与。细胞微小核酸核糖蛋白质、信使RNA等均是外泌体来源，在急性脑梗死进展中，会有蛋白质、RNAs转移的情况，对其神经、血管及胶质细胞产生影响，对急性脑梗死者细胞通信功能进行调节，从而作为脑梗死诊治的重要指标[6]。此外，miRNA还能对急性脑梗死者预后进行判断，属潜在生物指标，其预测机制是miRNA会参与脑缺血的修复过程[7]。此外，miRNA被临床归纳为内源性单链非编码小分子RNA，其特点除核苷酸含量多以外，还有较高的保守度，能结合靶向mRNA者的非翻译区，从而对急性脑梗死者生物过程进行调节。脑梗死病理进展多样，有粥样动脉硬化、斑块破裂、细胞凋亡等，然miRNA在各病理过程中均发挥参与作用，且能对血管生成、少突胶质生成等发挥促进作用，使其后脑能得到重塑[8]。

miRNA分布广泛，除在细胞内含量高以外，在体液中也有较高含量，由于其外部存在脂蛋白或外泌体，故有较高的稳定性和生物特异性，其浓度会随疾病出现明显的变化，有敏感度高、特异度高的特点，且检测过程较简单，能对急性脑梗死者做出准确的判断[9-10]。外泌体对急性脑梗死者的影响，主要体现在miRNA的传递，其能自由通过血脑屏障，且有较高的稳定性，能对脑梗死进展过程进行影响。有研究发现，血清外泌体于急性脑梗死者而言，miRNA表达会出现较大变化，其中增长趋势明显的即是促癌miRNA。在该研究的检测中，miRNA始终有外泌体的保护，能对血液RNA酶的降解进行预防，使其稳定性提高，且其介导细胞通讯功能，可对靶细胞基因表达进行抑制[11]。而在急性脑梗死者的各项检查中，外泌体miRNA检测有无创伤的特点，仅经血液样本获取便能进行检测，重复性强，敏感度高，经济性高，相比传统活检、CT、MRI等更值得使用[12]。经血清外泌体miRNAs的检测后可发现，miR-20b-5p相对表达量在研究组比对照组高。此研究结果表明，miR-20b-5p能对急性脑梗死做出相对准确的判断，以其数值为依据，还能对急性脑梗死的进展进行预测，继而对治疗措施进行调节，使急性脑梗死者预后改善。

综上所述，急性脑梗死病理特征明确，经血清外泌体miRNAs能对其做出准确的判断，可为急性脑梗死预防、诊治提供参考。