戈宝麻中总黄酮含量测定方法优化工艺研究

蒋晓玲，李 飞，窦维佳，马艳琳，姚 武＊

1.吉木乃海关，新疆阿勒泰 836500

2.阿勒泰海关，新疆阿勒泰 836500

戈宝麻，罗布麻夹竹桃科茶叶花属作物，学名Apocynum Venetum L.，多年生野生草本韧皮纤维植物，在我国几乎濒临灭绝，维吾尔语称其为“克孜其干”，新疆人称为“小花罗布麻”，在中国西北至东北十多个省均有零星分布，以新疆罗布泊西北方向兴地峡谷和阿勒泰阿拉哈克盐湖边生长的为上品，在新疆阿勒泰地区因其特殊的生态环境及品质，由刘起堂更名为戈宝麻，其叶的总黄酮含量、氨基酸含量均很高，是《中国药典》规定的最低标准的4～5倍。虞颖映等研究表明罗布麻茶在人体摄入量100倍范围内对实验动物的各项毒理学指标未产生毒理作用，可作为安全的天然植物茶，它具有降血压、治疗气管炎、感冒的作用，还有抗辐射、抗衰老等功能。此外还可以用于治疗抑郁和焦虑等疾病，和市面上的抗抑郁类药物相比，有着治疗效果好、毒副作用少、药用成本低等优点，受到了广泛关注，这也就扩大了戈宝麻的药用范围。总黄酮含量是评价罗布麻茶出口品质的一项重要指标，但是总黄酮含量测定在试剂过程中遇到了很多问题且操作比较复杂,如吸附剂粒度大小的问题、洗脱后溶液测定前放置时间的问题、乙醇浓度等问题。测定总黄酮含量有多种方法，包括液相色谱法、紫外区直接测定法、超声提取法等。由新疆阿勒泰罗布麻有限公司生产的戈宝麻茶主要出口至日本和韩国等地区。我们对目前我国统一采用《保健食品检验与评价技术规范实施手册》（2003版）中的方法、前人所做方法及本实验室前期制定的方法进行优化整合，建立了快速高效的测定方法，为进一步服务地方发展，保障出口戈宝麻茶的品质，加快企业的通关速度具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 样品、主要试剂及仪器

戈宝麻茶（由新疆阿勒泰罗布麻有限公司提供）；无水乙醇（天津市富宇精细化工有限公司）；石油醚（天津市富宇精细化工有限公司）；聚酰胺粉（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂出品）；甲醇（西安化学试剂厂）；聚酰胺层析柱（安捷伦）；粉碎仪（Retsch）；旋蒸仪（上海东玺制冷仪器设备有限公司）；超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；均质仪（德国Heidolph）；紫外分光光度计（ThermoFisherscientific）；水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）。

1.2 标准曲线

参照《保健食品检验与评价技术规范实施手册》中总黄酮的测定配制标准液，绘制标准曲线。

1.3 方法

1.3.1 操作步骤

图1 操作工艺图

采样方法参照GB/T8302进行，取样用具和盛器应符合食品卫生有关规定，采取随机取样的方法采取相应量的戈宝麻茶，将戈宝麻茶样品混合均匀，取适量用粉碎仪粉碎，置于取样袋，备用。

1.3.2 不同乙醇浓度提取总黄酮

分别称取0.5g粉碎后的戈宝麻茶于鸡心瓶，第一组实验加入50mL50%乙醇，第二组实验加入50 mL 75%乙醇，第三组实验加入50 mL80%乙醇，第四组实验加入50mL90%乙醇摇匀，频率53Khz60℃超声波清洗器中超声提取30min，过滤，取滤液0.5mL加入到含1g聚酰胺粉的蒸发皿中（滤液均匀分布），水浴83℃挥干乙醇，用漏斗转移至聚酰胺层析柱中，25mL石油醚洗涤，吹干。用甲醇洗脱至聚酰胺粉为无色，收集洗脱液，旋蒸仪对洗脱液进行浓缩，用比色管定容至10mL。甲醇调零，于360nm紫外分光光度计下测定吸光度值。每个样品分别设3个重复。

1.3.3 乙醇不同加入方式提取总黄酮

分别称取0.5g粉碎后的戈宝麻于鸡心瓶，第一组实验用1.3.2确定的乙醇浓度定容至 50 mL，第二组实验直接加入50mL相应浓度乙醇，其余步骤同1.3.2。每个样品分别设3个重复。

1.3.4 不同蒸馏时间提取总黄酮

分别称取0.5g粉碎后的戈宝麻于鸡心瓶，用1.3.3确定的乙醇浓度及1.3.4确定的乙醇加入方式加入鸡心瓶，摇匀，用83℃热水回流1h、2h、3h、6h、8h。其余操作步骤同1.3.2。每个样品分别设3个重复。

1.3.5 高温振荡提取总黄酮

分别称取0.5g粉碎后的戈宝麻置于烧杯中，第一组实验置于13000rpm/min均质仪中1 min，第二组实验置于83℃水浴摇床振荡30 min，第三组实验置于13000rpm/min均质仪中1min后83℃水浴振荡30min。其余操作步骤同1.3.2。每个样品分别设3个重复。

1.3.6 回收率试验

将已知浓度芦丁标准液加入含1g聚酰胺粉的蒸发皿中（滤液均匀分布），水浴83℃挥干乙醇，用漏斗转移至聚酰胺层析柱中，25mL石油醚洗涤，吹干。其余操作方法同1.3.2。

芦丁回收率%=(实际测得芦丁含量/理论上芦丁含量)×100%

2 结果与分析

2.1 芦丁标准品标准曲线图

按照1.2中方法对标准芦丁溶液进行吸光度测定，以浓度对吸光度值做标准曲线，如图2所示。线性回归方程为Y＝0.0272X-0.0033，总黄酮含量（以芦丁计）在0～25ug/mL范围内，符合朗伯比尔定律，关系数0.2＜A＜0.8，线性关系良好。

图2 芦丁标准品标准曲线图

2.2 乙醇浓度的确定

按照1.3.2测定不同乙醇浓度提取总黄酮所得量，于360nm波长下测定吸光度，计算所得结果如表1所示。结果显示，戈宝麻采用75%乙醇作为提取液时，提取效率较高，采用t检验，P＜0.01，差异性极显著。

表1 乙醇浓度试验

2.3 乙醇加入方式的确定

按照1.3.4测定不同加入方式加入2.2确定的75%乙醇，计算结果如表2所示，定容至50 mL的提取效率高于直接加入50mL乙醇的提取效率，采用t检验，P＜0.01,差异性极显著。

表2 乙醇加入方式试验

2.4 蒸馏时间（加热回流时间）

按照1.3.4测定不同加热回流时间的总黄酮提取率，计算结果如表3所示，结果显示6h后提取的总黄酮含量均值达3.92g/100g，采用t检验，分析加热回流后的提取效果，P＜0.01，差异性极显著。

表3 蒸馏时间试验

2.5 高温振荡提取总黄酮

按照1.3.5中用13000rpm/min的均质仪及83℃摇床中总黄酮含量的测定，计算结果如表4所示。结果表明，1min均质仪后，于83℃水浴摇床中30 min总黄酮提取量均值为3.62 g/100g，采用t检验，两两分析结果表明，P＜0.01，差异性极显著。

表4 高温振荡提取总黄酮

2.6 回收率

按1.3.6测得芦丁平均回收率为102.03%。

3 讨论

在我国中草药植物发展的历史长河中，罗布麻有着举足轻重的地位，尤其在新疆，已在人们的日常生活中发挥着极为特殊的健康作用。与普通罗布麻相比，新变种阿勒泰戈宝麻无论在有效成份含量亦或是珍稀程度上，均堪称上品。大量研究表明，罗布麻含有多种化学成分，包括黄酮类，糖苷类，甾醇类，酸类，氨基酸类，微量元素类（钠、钙、镁、铁、钾、锰）等物质，其中黄酮类是其主要成分，含量在0.2%～2.5%。它可以降血压、降血脂、抗抑郁、抗氧化等作用。目前我国规定的保健食品中总黄酮的测定主要采用紫外分光光度法和硝酸铝显色法2种方法，不同的测定方法对罗布麻同一材料的测定结果不完全相同，有时甚至可能会有较大差异。为了提高总黄酮提取量，有效评价出口戈宝麻茶的功效，我们采取了多种方法进行优化。

实验结果表明，本实验方法简单快速，回收率为102.03%，利用本法提取得到的黄酮类物质纯度较高。本实验首先通过乙醇加入方式进行了比较，提取结果显示定容加入乙醇的方式效果优于直接加入乙醇的方式，差异性极显著，可能是由于直接加入乙醇的量大于定容乙醇的量，稀释了戈宝麻茶中总黄酮的量。

通过比较本实验室采用的75%乙醇提取总黄酮含量与前人使用的80%乙醇相比较，差异性显著，75%乙醇提取效果优于80%，据文献报道，黄酮物质高效液相色谱分析结果说明，水提取物中主要是芦丁和绿原酸，50%醇提取物中主要是芦丁和原儿茶酸，95%醇提取物种主要是芦丁，从本实验结果说明戈宝麻茶中总黄酮成分大多是脂溶性成分。

通过比较不同乙醇浓度及不同乙醇加入方式超声波提取30min、加热回流时间梯度及均质1min置于83℃摇床30min中比较总黄酮提取量，发现加热回流时间6h和均质1min置于83℃摇床30min中效果较好，均值分别为3.92g/100g和3.62g/100g。出于用简单、快速、高效的方法提取戈宝麻中总黄酮含量，加快企业通关速度，我们选择后者作为黄酮测定的方法。对于随着蒸馏时间的加长能否继续提升黄酮提取含量，有待我们进一步研究。

采用75%乙醇作为提取液定容至50mL，均质1min置于83℃摇床30min中的方法与保健食品检验与评价技术规范实施手册的区别见表5。

表5 与保健食品检验与评价技术规范实施手册区别

4 结论

定容加入乙醇的方式总黄酮含量效果优于直接加入乙醇的方式。75%乙醇提取总黄酮含量的效果较好。本方法建议戈宝麻茶中总黄酮提取方法具有较好效果的处理条件为：一是采用75%乙醇作为提取液，定容至50mL，加热回流时间6h；二是采用75%乙醇作为提取液定容至50mL，均质1min置于83℃摇床30min中效果较好。