三叶木通果肉提取物的体外抗氧化及抑制α-葡萄糖苷酶和乙酰胆碱酯酶能力

丁林玲 谢颖欣 高伟 于丽娟 李宏 王振兴 张雪春

摘要：【目的】研究三葉木通果肉提取物的体外抗氧化及抑制α-葡萄糖苷酶和乙酰胆碱酯酶的能力，为三叶木通的开发利用提供参考依据。【方法】以三叶木通果肉为原料，经乙醇提取得到粗提物，再经不同溶剂依次萃取后得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇相萃取物和水层残余物;以DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、铁还原能力及氧化自由基吸收能力为指标，评估各萃取物的体外抗氧化活性;以各萃取物对α-葡萄糖苷酶和乙酰胆碱酯酶的抑制能力为指标，考察其体外降血糖和防治老年痴呆的能力。【结果】三叶木通果肉石油醚相萃取物的DPPH自由基清除能力最强，为54.02 mg Trolox/g;氯仿相的ABTS自由基清除能力和氧化自由基吸收能力最强，分别为320.66和266.87 mg Trolox/g;粗提物的铁还原能力最强，为557.36 mg FeSO4/g;氯仿相抑制α-葡萄糖苷酶和乙酰胆碱酯酶的能力均最强，半抑制浓度（IC50）分别为0.93和1.22 mg/mL。相关分析结果表明，除ABTS自由基清除能力与铁还原能力之间的相关性不显著（P>0.05，下同）外，4个抗氧化能力测定结果间均呈极显著正相关（P<0.01），相关系数为0.659～0.970;α-葡萄糖苷酶抑制能力的IC50与4个抗氧化能力测定结果之间相关性不显著，相关系数为-0.485～-0.412;乙酰胆碱酯酶抑制能力的IC50与铁还原能力呈显著负相关（相关系数为-0.556，P<0.05），与DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和氧化自由基吸收能力之间相关性不显著，相关系数为-0.541～-0.434。【结论】三叶木通果肉提取物具有一定的体外抗氧化及α-葡萄糖苷酶和乙酰胆碱酯酶抑制能力，有被开发为具有降血糖、防治老年痴呆活性的天然抗氧化剂和保健食品的潜力。

关键词： 三叶木通;果肉;体外抗氧化;α-葡萄糖苷酶;乙酰胆碱酯酶

中图分类号： S567.19;TS209                           文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）04-1058-08

In vitro antioxidant activities， α-glucosidase and acetylcholinesterase inhibition ability of

Akebia trifoliata pulp extracts

DING Lin-ling1， XIE Ying-xin2， GAO Wei3， YU Li-juan4， LI Hong4，

WANG Zhen-xing1， ZHANG Xue-chun1*

（1College of Life Sciences， Southwest Forestry University，Kunming  650224， China; 2Zhuhai No.4 Middle School，Zhuhai， Guangdong  519015， China; 3Jiangxi Academy of Forestry， Nanchang  330013， China; 4Research Institute of Product Processing， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming  650033， China）

Abstract：【Objective】In order to provide a theoretical basis for the development and utilization of Akebia trifoliata，the in vitro antioxidant，α-glucosidase inhibition，and acetylcholinesterase inhibition ability of Akebia trifoliata pulp extract were investigated. 【Method】The A. trifoliata pulp was extracted with ethanol，and the crude extract was further partitioned using different polarity solvents，where petroleum ether，chloroform，ethyl acetate，n-butanol phase extract and water residue were obtained. The in vitro antioxidant activity was evaluated using the DPPH radical scavenging ability，ABTS radical scavenging ability，ferric reducing antioxidant power，and oxygen radical absorbance ability. The α-glucosidase inhibition ability and acetylcholinesterase inhibition ability were carried out to quantify the potential of hypoglycemic effect and anti-Alzheimer effect. 【Result】The petroleum ether phase extract exhibited the strongest DDPH radical scavenging ability with the value of 54.02 mg Trolox/g，and chloroform phase extract posed the strongest ABTS radical scavenging ability （320.66 mg Trolox/g） and oxygen radical absorbance ability（266.87 mg Trolox/g），while the crude extract showed the highest ferric reducing antioxidant power（557.36 mg FeSO4/g）. The chloroform phase extract showed the strongest α-glucosidase ability with the half inhibition concentration rate（IC50） value of 0.93 mg/mL，and chloroform phase extract showed the strongest acetylcholinesterase inhibition ability， and IC50 value was 1.22 mg/mL. The correlation analysis showed that the relationships among all antioxidant assay results were extremely significant（P<0.01）， correlation coefficient range was 0.659-0.970， except the relationship between ABTS radical scavenging capacity and ferric reducing antioxidant power（P>0.05， the same below）. The IC50 of α-glucosidase inhibition ability had  not significant correlation with four antioxidant abilities（correlation coefficient range was between -0.485 and -0.412）. A significant negative correlation was found between the IC50 of acetylcholinesterase inhibition ability and ferric reducing antioxidant power（correlation coefficient was -0.556，P<0.05），while there were no significant correlation with the DPPH radical scavenging ability， ABTS radical scavenging ability，and oxygen radical absorbance ability（correlation coefficient range was between -0.541 and -0.434）. 【Conclusion】The above results indicate that A. trifoliata pulp extracts have certain in vitro antioxidant ability，α-glucosidase inhibition ability，and acetylcholinesterase inhibition ability. A. trifoliata has the potential to be developed as a natural antioxidant and healthy food with antidiabetic and anti-Alzheimer activity.

Key words： Akebia trifoliata; pulp; in vitro antioxidation; α-glucosidase; acetylcholinesterase

Foundation item： Major Science and Technology Project of Yunnan（2018ZG004）; The Joint Special Youth Project of Basic Agricultural Research in Yunnan（2017FG001（-078））; Scientific Research Fund Project of Yunnan Education Department（2016ZZX150）

0 引言

【研究意义】三叶木通（Akebia trifoliata，AT）又称八月瓜、八月炸，为木通科木通属植物，广泛分布于我国长江流域及南方各省份。其营养价值高，色香味俱佳，可食用也可药用，具有消热利尿、通经活络、镇静止痛、抗炎消肿和排乳等功效（刘勇等，2004;吴连花等，2010），目前已在贵州、江西、广西等地大量种植，成为当地的重点发展产业之一。研究表明，三叶木通富含黄酮类、酚类、脂肪酸类、三萜、糖苷、皂苷和木脂素类等成分，具有抗氧化、抗癌等功能活性（李香等，2008;刘岩庭等，2012;卢旭然等，2014;郑勇等，2018）。三叶木通的可食用部位主要为果肉，约占鲜果重的50%，但对其果肉的研究相对较少，不同组分的成分和活性区别尚不明确，因此，针对果肉的成分和功能进行研究，对于三叶木通资源的开发利用具有重要意义。【前人研究进展】目前对于三叶木通果肉部位的研究主要集中在营养成分分析和食品开发（仲伟敏和马玉华，2015;任攀等，2016;余兴恒等，2019），对其抗氧化活性和酪氨酸酶抑制活性等也有一些研究報道。彭涤非等（2008）采用80%乙醇提取法进行三叶木通果皮、果肉和种子中有效成分的研究，结果发现不同部位的乙醇提取物对体外酪氨酸酶活性均有一定的抑制作用，其中果肉的抑制作用最佳。张孟琴等（2008）采用圆纸片扩散法对提取的三叶木通果皮果胶进行抑菌和杀菌性能研究，结果表明三叶木通果皮果胶无抑菌和杀菌作用。邵显会（2012）研究发现三叶木通多糖达到一定浓度时其抗氧化能力仅次于维生素C（VC），三叶木通粗黄酮和纯化后黄酮的抗氧化能力仅次于2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）。陆俊等（2016）采用超声波提取法对三叶木通不同部位进行提取研究，结果测得三叶木通藤茎提取物的1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）自由基清除能力、2，2'-联氮基-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）自由基清除能力和铁还原能力值分别为380.86、337.18和387.41 ?mol Trolox/g。郭林新等（2017a）发现三叶木通提取物的正丁醇萃取部位具有显著利尿作用，其主要化学成分为苷类化合物。【本研究切入点】目前，尚未见针对三叶木通果肉不同溶剂萃取物的功能活性进行分析和比较的文献报道。【拟解决的关键问题】以三叶木通果肉为研究对象，经乙醇提取得到粗提物，再经不同溶剂依次萃取后得到不同溶剂萃取物，研究各萃取物的体外抗氧化能力及对α-葡萄糖苷酶和乙酰胆碱酯酶的抑制能力，以评估三叶木通抗氧化、降血糖和防治阿尔茨海默病的潜力，为三叶木通的开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试材料为黎平盛竹联创木通农林发展有限公司提供的三叶木通，采集自贵州省黔东南州黎平县敖市镇梧寨村。酿酒酵母α-葡萄糖苷酶、阿卡波糖、4-甲基伞形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-MUG）和乙酰胆碱酯酶（AChE）购自Sigma-Aldrich公司;ABTS、DPPH、2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、2，2'-偶氮-双-（2-脒基丙烷）氯化二氢（AAPH）、荧光素钠、碘化硫代乙酰胆碱（ATCI）、加兰他敏、5，5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、奎诺二甲基丙烯酸酯（Trolox）、VC和BHT等均为分析纯。主要仪器设备：TGL-10C型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）、SHB-III型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）、RE-52型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、SYNERGY H1型多功能酶标仪（美国BIOTEK公司）、HH-2型数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）、DGH-9140A型数显电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）和SG5200HDT型超声波清洗器（上海冠特超声仪器有限公司）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 样品提取 称取200 g果肉，按1∶20的固液比（w/v）加入4000 mL 70%乙醇混合，调节pH至5，加入0.67%纤维素酶（活力3 U/mg）和0.05%果胶酶（活力40 U/mg），在超声波功率500 W、温度50 ℃的条件下提取60 min后，4000 r/min离心15 min，收集上清液，残渣在相同条件下提取2次;合并所有上清液，减压浓缩至500 mL，依次用不同极性有机溶剂萃取，得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇相萃取物、水层残余物及粗提物，50 ℃下真空旋干后冷冻干燥，将所得冻干样品置于-20 ℃保存用于后续分析。

1. 2. 2 体外抗氧化活性测定

1. 2. 2. 1 DPPH自由基清除能力 参考Zhang等（2016）的方法，冻干样品用冻干粉复溶至适合浓度，取100 ?L样品溶液，加入100 ?L 0.15 mmol/L DPPH溶液，室温避光反应30 min，在517 nm处测定其吸光值As，以样品溶剂代替样品为样品空白组Ac，以70%甲醇溶液代替DPPH溶液为样品控制组Ab，按公式（1）计算清除率。同时以不同浓度（0～25 ?g/mL）Trolox溶液代替样品与DPPH溶液反应，计算其清除率，绘制Trolox浓度与清除率的标准曲线，样品的DPPH自由基清除能力用Trolox当量表示，即为每克样品相当于标准抗氧化剂Trolox的质量（mg），以Vc和BHT为阳性对照。

清除率（%）=[AC-（AS-Ab）AC]×100  （1）

1. 2. 2. 2 ABTS自由基清除能力 参考Zhang等（2017）的方法，取50 ?L样品溶液，加入200 ?L ABTS溶液，室温避光反应6 min，在734 nm处测定其吸光值，清除率计算同公式（1）。样品的ABTS自由基清除能力同样用Trolox当量表示，以VC和BHT为阳性对照。

1. 2. 2. 3 铁还原能力（FRAP）  参考Escribano等（2017）的方法并略加修改，取30 ?L样品溶液，加入240 ?L FRAP工作液，37 ℃避光温育10 min，在593 nm处测定其吸光值，计算同公式（1）。同时以不同浓度（0～100 ?g/mL）FeSO4溶液代替样品与FRAP工作液反应，绘制FeSO4浓度与吸光值的标准曲线，样品的FRAP值用FeSO4当量表示，即为每克样品相当于FeSO4质量（mg），以VC和BHT为阳性对照。FRAP值越大，则样品的铁还原能力越强。

1. 2. 2. 4 氧化自由基吸收能力（ORAC） 参考Romero-Díez等（2018）的方法，取25 ?L样品溶液，加入150 ?L荧光素钠溶液（8×10-5 mol/L），振荡5 min，37 ℃温育10 min，迅速加入50 ?L AAPH溶液启动反应。以激发波长485 nm、发射波长535 nm进行测定并记录荧光值，测定时间为2 h，每隔1 min测定一次荧光值，每次测定前中速振动酶标板10 s。计算各孔不同时间点的荧光强度与初始荧光强度的比值f，以测定时间为横坐标、f为纵坐标绘制样品的荧光衰变曲线，采用近似积分法计算荧光衰退曲线面积（AUC）。计算同公式（1），式中As为样品的AUC值，以样品溶剂代替样品为样品空白组Ac，以70%甲醇溶液代替AAPH溶液为样品控制组Ab，同时以不同浓度Trolox溶液代替樣品与荧光素钠稀释液和AAPH溶液反应，绘制Trolox浓度与AUC的标准曲线，样品的ORAC值用Trolox当量表示。以VC和BHT为阳性对照。

1. 2. 3 抑制α-葡萄糖苷酶能力测定 参考Liao和Banbury（2015）的方法并略加修改，取50 μL样品溶液，加入20 μL α-葡萄糖苷酶溶液（0.175 U/mL，pH 6.8磷酸钾缓冲液配制）和50 μL 4-MUG（0.84 μmol/L，pH 6.8磷酸钾缓冲液配制），充分混匀，37 ℃避光温育20 min后，加入100 μL甘氨酸钠溶液（100 mmol/L，pH 10.6）振荡30 s终止反应。以激发波长355 nm、发射波长460 nm进行测定并记录荧光值，以阿卡波糖为阳性对照。抑制率按公式（2）进行计算，式中As为样品的荧光值，以样品溶剂代替样品为样品空白组Ac，以磷酸钾缓冲液代替酶液为样品控制组Ab。

清除率（%）=[（AC-Ab）-（AS-Ab）AC-Ab]×100  （2）

1. 2. 4 抑制乙酰胆碱酯酶能力测定 参考Malar等（2017）的方法，取50 μL样品溶液，加入15 μL ATCI溶液（15 mmol/L）和75 μL DTNB溶液（3 μmol/L，pH 8.0磷酸钠缓冲液配制），30 ℃孵化10 min后，加入20 μL乙酰胆碱酯酶溶液（0.1 U/mL，pH 8.0磷酸钠缓冲液配制）充分混匀，最后加入50 μL磷酸钠缓冲液（pH 8.0）振荡10 s终止反应，在405 nm处测定其吸光值（As），每隔1 min测定一次，共测5次，每次测定前中速振动酶标板10 s，以加兰他敏为阳性对照。抑制率计算同公式（2），以样品溶剂代替样品为样品空白组Ac，以磷酸钠缓冲液代替酶液的反应体系样品控制组Ab。

1. 3 统计分析

所有试验平行测定3次，试验结果以平均值±标准偏差表示。采用SPSS 22.0进行单因素方差分析（ANOVA）及相关分析，以Origin 2017进行曲线拟合计算半抑制浓度（IC50）。

2 结果与分析

2. 1 体外抗氧化能力测定结果

2. 1. 1 DPPH自由基清除能力 DPPH自由基是一种以氮为中心的稳定自由基，常用于反映样品抗氧化能力强弱（王晓宇等，2012）。由表1可知，三叶木通各萃取物及对照的DPPH自由基清除能力排序为VC>石油醚相>氯仿相>粗提物>BHT>正丁醇相>乙酸乙酯相>水层残余物。石油醚相、氯仿相和粗提物表现出较强的DPPH自由基清除能力，虽低于阳性对照VC，但均显著高于BHT（P<0.05，下同）;正丁醇相和乙酸乙酯相清除DPPH自由基的能力显著低于石油醚相、氯仿相和粗提物，而水层残余物清除DPPH自由基效果最差。

2. 1. 2 ABTS自由基清除能力 ABTS溶液可释放稳定的有机自由基，与样品中还原性物质提供的电子反应，因此可通过测定反应体系吸光度的变化，来反映样品抗氧化能力的大小（Fatiha et al.，2015）。三叶木通各萃取物及对照清除ABTS自由基能力的排序为VC>BHT>氯仿相>石油醚相>粗提物>正丁醇相>乙酸乙酯相>水层残余物（表1）;各萃取物均具有一定的抗氧化活性，其中氯仿相清除ABTS自由基的能力最强，水层残余物的ABTS自由基清除能力远低于其他萃取物，各萃取物清除ABTS自由基的能力与阳性对照VC和BHT比较仍有一定差距。

2. 1. 3 FRAP FRAP与DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力不同，不是针对一种自由基的清除活性，其测定的是抗氧化物质氧化还原的潜力（王晓宇等，2012）。由表1可知，三叶木通各萃取物及对照的FRAP值排序依次为VC>BHT>粗提物>石油醚相>氯仿相>正丁醇相>乙酸乙酯相>水层残余物。各萃取物均具有一定的FRAP，但均弱于阳性对照VC和BHT;各萃取物中，以粗提物的FRAP最强，显著高于其他萃取物的铁还原能力，而水层残余物的FRAP最弱。

2. 1. 4 ORAC ORAC反映样品的总抗氧化能力，具有专一性强、生物相关性强、可标准化和自动化等优点。三叶木通各萃取物的ORAC值见表1，粗提物的氧化自由基吸收能力未测出，其余各萃取物及对照的ORAC值排序依次为VC>氯仿相>石油醚相>BHT>乙酸乙酯相>正丁醇相>水层残余物。各萃取物中氯仿相和石油醚相的ORAC较强，虽低于阳性对照VC但显著高于BHT;乙酸乙酯相和正丁醇相的ORAC显著低于氯仿相和石油醚相，水层残余物的ORAC最弱。

2. 2 α-葡萄糖苷酶抑制能力测定结果

各萃取物抑制α-葡萄糖苷酶能力如图1所示，其中石油醚相萃取物抑制α-葡萄糖苷酶的IC50未测出，其余各萃取物及对照的IC50排序为阿卡波糖（0.19±0.02 mg/mL）>氯仿相（0.93±0.06 mg/mL）>乙酸乙酯相（0.94±0.04 mg/mL）>粗提物（3.67±0.29 mg/mL）>正丁醇相（8.11±2.20 mg/mL）>水层残余物（62.60±1.58 mg/mL）。氯仿相和乙酸乙酯相具有较强的抑制α-葡萄糖苷酶能力，且与阿卡波糖无显著差异（P>0.05）;粗提物和正丁醇相次之，而水层残余物的抑制活性最低。

2. 3 乙酰胆碱酯酶抑制能力测定结果

各萃取物抑制乙酰胆碱酯酶能力如图2所示，其中粗提物抑制乙酰胆碱酯酶的IC50未测出，其余各萃取物的IC50排序依次为氯仿相（1.22±0.01 mg/mL）>石油醚相（1.32±0.04 mg/mL）>乙酸乙酯相（1.52±0.06 mg/mL）>正丁醇相（5.35±0.46 mg/mL）>水层残余物（157.96±0.28 mg/mL）。虽然各萃取物的IC50均显著高于阳性对照加兰他敏（1.12±0.32 μg/mL），但仍表现出一定的抑制能力;其中，氯仿相、石油醚相和乙酸乙酯相的抑制活性较高，正丁醇相次之，而水层残余物的抑制活性最低。

2. 4 相关分析结果

利用SPSS 22.0对抗氧化能力测定结果与α-葡萄糖苷酶、乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制能力的IC50进行相关分析，结果见表2。DPPH自由基清除能力与ABTS自由基清除能力、FRAP和ORAC的相关系数分别为0.659、0.694和0.945，均呈极显著正相关（P<0.01，下同）;ORAC与ABTS自由基清除能力和FRAP的相关系数分别为0.970和0.930，也呈极显著正相关。

α-葡萄糖苷酶抑制能力的IC50与4种抗氧化能力测定结果均呈负相关，且相关性不显著，其相关系数为-0.485～-0.412;乙酰胆碱酯酶抑制能力的IC50与4種抗氧化能力测定结果也呈负相关，相关系数为 -0.556～-0.434，其中与FRAP呈显著负相关，与其他3个抗氧化指标的相关性不显著。

3 讨论

体外抗氧化研究结果表明，三叶木通的主要抗氧化活性部位为石油醚相、氯仿相萃取物和粗提物，其中石油醚相萃取物的DPPH自由基清除能力、氯仿相萃取物的ABTS自由基清除能力和氧化自由基吸收能力、粗提物的铁还原能力均接近或超过商业抗氧化剂BHT。三叶木通清除DPPH自由基的活性成分主要存在于氯仿相和石油醚相中，与郭林新等（2017b）、郭艳玲（2017）的研究结果一致;各萃取物对ABTS自由基清除能力的变化趋势与DPPH自由基清除能力类似，与李华等（2008）的研究结果一致。4种抗氧化能力测定结果间的相关性较好，可共同作为评价样品抗氧化能力的有效指标。刘曦等（2013）分别采用不同极性溶剂对蓝莓叶进行提取，发现其不同相的抗氧化活性与其多酚和黄酮类物质的含量相关，而多酚和黄酮是样品呈现抗氧化能力的主要活性成分。由此推测三叶木通石油醚相、氯仿相萃取物和粗提物中的多酚和黄酮含量较高，可能是这几个萃取相抗氧化活性较高的主要原因。

糖尿病是一种常伴有并发症的慢性代谢紊乱性疾病，目前已成为危害人类健康的全球第三大疾病。糖尿病有四大类型，其中Ⅱ型糖尿病占90%以上。α-葡萄糖苷酶抑制剂是对Ⅱ型糖尿病有确切疗效的口服降糖药，其通过竞争性抑制小肠上α-葡萄糖苷酶的活性，从而阻碍多糖的分解和延缓葡萄糖的吸收，使餐后血糖水平降低（许芹永，2012）。本研究中，三叶木通各萃取物表现出一定的α-葡萄糖苷酶抑制能力，其活性成分集中于氯仿相和乙酸乙酯相中。阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD），又称老年性痴呆，是一种慢性神经衰退症。目前AD的发病机制尚不明确，利用乙酰胆碱酯酶抑制剂（AChEIs）来抑制乙酰胆碱酯酶活性是临床上治疗AD的重要手段（张耀东等，2012;杨赟等，2013）。本研究中，乙酰胆碱酯酶抑制活性成分集中于氯仿相、石油醚相和乙酸乙酯相中。虽然这些萃取物的IC50低于阳性对照药物阿卡波糖和加兰他敏，但高于一些中药材提取物，如金银花、五指毛桃、鸡血藤、藜蒿等（殷帅文等，2012;周思多等，2015;丁运华等，2017;谢星等，2020）。姚志仁等（2020）探究黄花倒水莲醇提物不同萃取物的抗氧化和降血糖活性，发现黄花倒水莲抑制α-葡萄糖苷酶的可能活性成分为多酚类物质，因此本研究推测三叶木通抑制α-葡萄糖苷酶和乙酰胆碱酯酶抑制活性成分可能是氯仿相、石油醚相和乙酸乙酯相中的多酚类物质。后续拟对三叶木通果肉中活性成分进行进一步分离和结构鉴定、体内活性评估等研究。在体外降血糖活性筛选的基础上，选择活性最佳的成分或组分，建立糖尿病小鼠模型，对其灌胃喂养活性成分，通过考察小鼠生理理化指标、血糖变化等评价其体内降血糖能力。

4 结论

三叶木通果肉不同溶剂萃取物具有一定的体外抗氧化及抑制α-葡萄糖苷酶和乙酰胆碱酯酶能力，有被开发为具有降血糖、防治老年痴呆活性的天然抗氧化剂和保健食品的潜力。

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（責任编辑 罗 丽）