番茄Trihelix家族SIP1亚家族基因（SlGT-33）克隆表达分析及功能研究

崔宝禄 陈国平

崔寶禄（1979-），副教授，主要从事番茄分子生物学研究工作。先后主持国家自然科学基金地区项目“黄单胞菌效应因子AvrBS3靶基因SlUPA-like调控植物畸形发育的机理研究”、贵州省基础研究项目“番茄SlUPA-like基因提高防御黄单胞杆菌病害的研究”、贵州省拔尖人才项目“番茄Trihelix转录因子GT-2亚家族SlGTL5基因应答非生物胁迫的分子机制研究”、贵州省农业重大产业科技攻关项目“校农结合扶贫点蔬菜立体栽培与采后处理技术示范”等科研项目10余项;申报国家专利10项，已授权发明专利1项，实用新型专利3项;以第一作者或通讯作者在《Scientific Reports》《Plant Physiology & Biochemistry》《Crop Science》《南方农业学报》《西北植物学报》《分子植物育种》等期刊上发表科技论文10余篇。

摘要：【目的】对番茄三螺旋（Trihelix）家族SIP1亚家族基因（SlGT-33）进行克隆表达及功能研究，为深入解析SIP1亚家族成员调控植物生长发育机制及选育矮化番茄品种提供理论依据。【方法】以番茄品种AC++为材料，PCR扩增SlGT-33基因，对其进行序列分析，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测SlGT-33基因在不同组织及外源激素和非生物胁迫下的表达模式，并利用RNAi技术鉴定SlGT-33基因的生物学功能。【结果】扩增获得的SlGT-33基因（GenBank登录号Solyc12g043090）开放阅读框（ORF）为1125 bp，编码374个氨基酸残基，与已知同源基因序列（GenBank登录号XP004252336.1）仅缺少3个碱基。SlGT-33与SlGT-17（GenBank登录号Solyc05g018350）位于同一分支，虽然二者的氨基酸序列相似性最高，但仅为45.8%。SlGT-33基因在茎和成熟叶中的相对表达量较高，显著高于其他组织（P<0.05，下同）;经IAA、GA3和MeJA处理后，SlGT-33基因的相对表达量均与对照无显著差异（P>0.05，下同）;SlGT-33基因经ABA处理2～24 h时相对表达量均显著高于对照。SlGT-33基因在高盐胁迫和机械损伤下的相对表达量与对照无显著差异;高温胁迫和低温胁迫下SlGT-33基因表达整体上均呈逐渐降低的变化趋势;在脱水胁迫下SlGT-33基因表达整体上均呈逐渐升高的变化趋势。通过农杆菌介导转化法获得6个SlGT-33-RNAi沉默株系，沉默效率为64%～83%。生长70 d的SlGT-33-RNAi沉默株系RNAi-4和RNAi-5幼苗株高和节间长度均为野生型的60%左右，且复叶结构尺寸明显变小，花序提前形成。茎尖组织中顶端分生组织关键转录因子基因KNOX2和WUS基因在SlGT-33-RNAi沉默株系的相对表达量均极显著（P<0.01）或显著高于野生型，腺苷酸异戊烯转移酶（CTK合成的关键酶）编码基因IPT2和茎尖生长点调控基因PHAN基因在2个SlGT-33-RNAi沉默株系的相对表达量均显著低于野生型。顶端分生组织关键转录因子基因KNOX1基因在2个SlGT-33-RNAi沉默株系的相对表达量与野生型无显著差异。SlGT-33-RNAi沉默株系茎尖组织的细胞分裂素（CTK）含量显著低于野生型。【结论】SlGT-33基因属于环境敏感型基因，其表达受ABA和脱水胁迫诱导，但受极端温度的抑制。抑制SlGT-33基因表达会导致了番茄植株矮化和生殖生长加速，其作用机制与顶端分生组织的CTK合成受抑制及茎尖组织调控基因KNOX2、PHAN和WUS的异常表达密切相关。

关键词： 番茄;SlGT-33基因;植株矮化;表达分析;功能研究

中图分类号： S641.203.6                             文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）04-0857-10

Cloning expression analysis and functions of SIP1 subfamily gene（SlGT-33） in tomato Trihelix family

CUI Bao-lu1， CHEN Guo-ping2

（1The Department of Life Science and Agriculture， Qiannan Normal University for Nationalities， Duyun， Guizhou 558000， China; 2 College of Bioengineering， Chongqing University， Chongqing  400044， China）

Abstract：【Objective】Cloning expression and function of SIP1 subfamily gene（SlGT-33） of tomato  Trihelix family to provide theoretical basis for analyzing the mechanism of SIP1 subfamily members regulating plant growth and development， and breeding of dwarf tomato varieties. 【Method】Using the tomato variety AC++， amplified its SlGT-33 gene by PCR， performed sequence analysis， and used real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR） to detect its expression patterns in different tissues and exogenous hormones and non-biological stress. Finally， the RNAi technique was used to identify the biological function of SlGT-33 gene. 【Result】The length of SlGT-33（GenBank accession number：Solyc12g 043090）open reading frame（ORF） was 1125 bp，encoding 375 amino acids residues， which was short of 3 bp than its homologous gene（GenBank accession number：XP004252336.1）. Phylogenetic analysis suggested that SlGT-33 protein was in the same branch with SlGT-17（GenBank accession number：Solyc05g018350），though the similarity between their amino acids sequence was the highest， the value was only 45.8%. SlGT-33 gene was significantly expressed in stem and mature leaves than other tissues（P<0.05， the same below）. After IAA， GA3， MeJA treatments， the expression of SlGT-33 gene did not differ significantly from control（P>0.05， the same below）. Compared to control，SlGT-33 could be significantly up-regulated by ABA within 2-24 h. SlGT-33 gene expression was not significantly different from control under high salt stress and mechanical damage. The expression of SlGT-33 gene decreased gradually under high temperature stress and low temperature stress，while expression of SlGT-33 gene increased gradually under dehydrationstress. Six SlGT-33-RNAi silent lines were harvested by Agrobacterium-mediated transformation and silence rate varied from 64% to 83%. The plant height and internode length of 70 d SlGT-33-RNAi silent lines decreased to 60% of wild types. The compound leaf structure was significantly smaller and the inflorescence formed in advance. The key transcription factor genes KNOX2 and WUS in stem tip tissue were extremely significantly expressed in the SlGT-33-RNAi silent lines（P<0.01） or significantly higher than the wild type. Adenylate isopentenyl transferase（key enzyme for CTK synthesis） encoded gene IPT2 and the stem tip growth point regulatory gene PHAN were expressed significantly lower in two SlGT-33-RNAi silent linesthan wild type. The expression of the apical biological tissue key transcription factor gene KNOX1 gene was not significantly different compared with in two SlGT-33-RNAi silentlines. Thecytokinin（CTK） of SlGT-33-RNAi silent line stem tip tissue was significantly lower than in the wildtype. 【Conclusion】SlGT-33 gene was sensitive to environment. It can be induced by ABA and dehydration stresses and suppressed by extreme temperature. But suppressed expression of SlGT-33 leads to dwarf plants and accelerating reproductive development，which is related with inhibition of CTK synthesis of apical meristem  and abnormal expressions of stem tip tissue key regulation genes KNOX2， PHAN and WUS.

Key words： tomato; SlGT-33 gene;dwarf plants; expression analysis;  functional study

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31960605）;Basic Research Project of Guizhou  Science and Technology Department （〔2018〕1144）;Top-notch Talent Support Project of Guizhou Education Department（Qianjiaohe〔2016〕111）;Major Technical Innovation Project of Qiannan Normal University for Nationalities（QNSY 2018PT001）

0 引言

【研究意義】番茄（Solanum lycopersicom）为多年生草本，在适宜条件下其顶端分生组织可无限生长。合理施用植物生长延缓剂可使植株矮化，抑制顶端无限生长（黄艳花等，2011），但缺乏遗传稳定性。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，对番茄矮化基因的功能研究也逐步深入，已发现番茄基因组可编码60多种转录因子，其中三螺旋（Trihelix）转录因子与植株矮化密切相关（Kaplan-Levy et al.，2012;Liu et al.，2020），因此研究该家族基因的功能对揭示植物生长发育机制及加速番茄矮化品种选育具有重要指导意义。【前人研究进展】Trihelix转录因子为植物特有，在植物形态发生、信号转导和胁迫响应等方面发挥重要作用，其调控机制为Trihelix结构域（螺旋—环/转角—螺旋—环/转角—螺旋）特异结合下游基因启动子的GT元件，进而调控靶基因表达（Liu et al.，2020）。Trihelix转录因子家族分为6个亚家族：GT-1、GT-2、SH4、SIP1、GT-γ和GT-δ（Kaplan-Levy et al.，2012），各亚家族成员的生物学功能逐步被鉴定。其中，GT-2亚家族成员的研究较深入，如PTL基因突变后，植株即出现矮化、叶片卷曲、花药无法开裂等表型（Li et al.，2008），且该基因主要作用于花瓣和萼片等花被器官发育，尤其对花器官的着生部位及方向起决定作用（Griffith et al.，1999;Brewer et al.，2004）;GTL1基因调控毛状体发育，该基因突变后，叶片毛状体的DNA含量增加2～3倍（Breuer et al.，2009）;GT-2基因可响应外源激素和非生物胁迫（崔宝禄等，2020）。GT-γ亚家族成员可响应盐、干旱等非生物胁迫，超表达后可提高植株耐盐性（Fang et al.，2010）。SIP1亚家族基因的功能研究相对薄弱。烟草NtSIP1含有Trihelix结构域，可促进6b因子的核定位（Kitakura et al.，2002）;拟南芥ASIL1除含有Trihelix结构域外，还含有甘氨酸和脯氨酸富集区，可结合到靶基因启动子区，抑制种子成熟（Gao et al.，2009），且ASIL1与ASIL2共同抑制胚胎成熟过程，表现为asil1asil2突变体胚胎中叶绿体和叶绿素的积累均有所增加（Barr et al.，2012）。此外，部分学者将C末端融合天冬氨酸/谷氨酸/尿苷激酶的Trihelix转录因子划入SIP1亚家族，且证实其功能可能与叶片暗绿、畸形发育有关;同属于SIP1亚家族的FRIGIDA-INTERACTING PROTEIN2（FIP2）基因5'端非编码区（5'-UTR）编码Trihelix结构域，其功能可能与春化诱导开花相关（Kaplan-Levy et al.，2012）。拟南芥SIP1亚家族蛋白AST1具有调控气孔开闭、脂质过氧化、细胞失水死亡等功能（Xu et al.，2018）。综上所述，SIP1亚家族基因参与植物种子形成、生长发育、非生物胁迫等过程。【本研究切入点】番茄具有基因组小、基因组测序完整、遗传转化效率高且稳定等诸多优点，但至今鲜见有关番茄SIP1亚家族基因功能的研究报道。【拟解决的关键问题】以番茄品种AC++为材料，PCR扩增其SIPI亚家族基因SlGT-33的开放阅读框（ORF），对其进行序列分析，并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测SlGT-33基因在不同组织及外源激素和非生物胁迫下的表达模式，最后利用RNAi技术鉴定SlGT-33基因的生物学功能，以期解析其调控植株矮化的分子机制，为深入解析SIP1亚家族成员调控植物生长发育机制及选育矮化番茄品种提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

番茄高度自交品种AC++[S. lycopersicom Mill. cv. Ailsa Craig（AC++）]引自重庆大学生物工程学院。高保真酶PrimerStar Max和M-MLV Reverse Transcriptas反转录酶购自TaKaRa公司，细胞分裂素（CTK）酶联免疫吸附剂测定（ELISA）试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，SYBR Premix Ex Taq II Kit购自Promega公司，其他生化试剂购自重庆凯飞科技有限公司。主要设备仪器包括ChemDoc XRS+凝胶成像系统（Bio-Rad，美国）及CFX96 Real-time PCR 检测系统（Bio-Rad，美国）等。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 组织样品采集 番茄AC++种植于黔南民族师范学院温室大棚内，光照16 h（27 ℃）和黑暗8 h （19 ℃）。待植株开花结果后，分别选取成熟植株的根（Root，RT）、茎（Stem，ST）、成熟叶（Mature leaf，ML）、花（Flower，FL）和果皮，其中果皮包括绿色果皮（GF）和红色果皮（RF），分别取自直径1 cm的果实和破色4 d后的果实。上述材料液氮速冻后置于 -80 ℃冰箱。AC++种子播种于营养钵中，生长35 d后用于外源激素处理和非生物胁迫。

1. 2. 2 总RNA提取及cDNA第一链合成 采取番茄组织样品用液氮速冻后，采用TRIzol试剂法提取总RNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA提取质量。以提取的总RNA为模板，采用M-MLV Reverse Transcriptas反转录合成cDNA第一链，用于后续的基因克隆及表达分析。

1. 2. 3 SlGT-33基因克隆 利用NCBI和茄科基因组数据库（SGN）的生物信息学搜索，采用NCBI设计引物SlGT-33-all-F和SlGT-33-all-R（表1），以cDNA为模板，PCR扩增SlGT-33基因ORF。反应体系（50.0 μL）：2×PrimerStar Max 25.0 μL， cDNA模板1.0 μL，10 mmol/L正、反向引物（SlGT-33-all-F和SlGT-33-all-R）各1.0 μL，去离子水补足至50.0 μL。扩增程序：98 ℃预变性5 min;98 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行36个循环。利用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测目的片段，并连接至pMD18-T载体上送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1. 2. 4 生物信息学分析 在SGN和NCBI数据库中搜索不同植物SIP1家族蛋白的氨基酸序列。将搜索获得的氨基酸序列进行多重序列比对，根据比对结果确定SIP1亚家族蛋白的保守结构域。基于不同植物SIP1蛋白的氨基酸序列进行系统进化分析，以预测其生物功能。采用MultAlin（http：//multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html）將cDNA与基因组进行序列比对，利用NCBI数据库的CDD网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）预测SlGT-33蛋白保守区。并以ClustalX和DNAMAN 6.0进行多重序列比对，采用MEGA 10.0.2构建系统发育进化树。

1. 2. 5 外源激素处理及非生物胁迫 取生长35 d的番茄幼苗，分别对其喷施50 μmol/L吲哚乙酸（IAA）、50 μmol/L赤霉素（GA3）、50 μmol/L茉莉酸甲酯（MeJA）、100 μmol/L脱落酸（ABA）和100 μmol/L 1-氨基环丙烷羧酸（ACC），以喷施水为对照，于0、1、2、4、8、12和24 h后取幼苗中部叶片进行液氮速冻，置于-80 ℃冰箱保存备用（Zhu et al.，2014）。设3次重复。

AC++种子播种于营养钵中，待生长35 d后获得番茄幼苗，分别对其进行高盐（以20 mmol/L NaCl缓慢浇灌到植物根部，直至盐水从花钵下面流出）、高温（40 ℃）、低温（4 ℃）、脱水（在水中缓慢清洗幼苗根系土壤，直至洗脱干净，置于室温下自然失水）和机械损伤（用剪刀剪碎叶片）等非生物胁迫处理，以未处理幼苗为对照，分别于胁迫0、1、2、4、8、12、24和36 h后选取处理幼苗的中部叶片，经液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存备用（Pan et al.，2012）。设3次重复。

1. 2. 6 基因表达分析 以cDNA为模板，qRT-PCR检测SlGT-33基因在不同组织及非生物胁迫和植物激素处理下的表达模式，并检测SlGT-33基因的下游基因表达情况 ，包括腺苷酸异戊烯转移酶（CTK合成的关键酶）基因（IPT2）、茎尖生长点调控基因（PHAN）及顶端分生组织关键转录因子基因（KNOX1、KNOX2和WUS）。其中，不同组织SlGT-33基因及其下游基因表达分析以SlCAC基因为内参基因，不同非生物胁迫和植物激素处理下基因表达分析以SlEF1a基因为内参基因，其引物如表1所示。qRT-PCR反应体系：5.0 μL 2×SYBR PreMixs，10 μmol/L正、反向引物（qSlGT-33-F和qSlGT-33-R）各0.5 μL，1.0 μL cDNA模板，以去离子水补足至10.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性2 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，进行36个循环。

1. 2. 7 基因沉默载体构建及沉默株系鉴定 经过NCBI生物信息学分析比对，从SlGT-33基因中鉴定其特异序列，并根据1.2.3中高保真PCR扩增方法得到长度为455 bp的片段，将该片段连接至pMD18-T载体上送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序正确后，采用EcoR I/Kpn I和Xba I/Hind III双酶切方式将该片段以正向和反向的方式连接至中间载体pHANNIBAL上，然后连接至终载体pBIN19上，最后转化农杆菌LBA4404。经番茄子叶侵染、愈伤组织培养和SlGT-33-RNAi沉默株系鉴定，获得沉默株系T0代，收集T0代种子，播种后得到T1代植株。

1. 2. 8 CTK含量测定 番茄植株内CTK含量测定：称取沉默株系和野生型植株成熟叶片0.5 g，用滤纸吸水后，液氮研磨，用80%甲醇抽提，1000 r/min离心20 min，取上清液，用孔径为0.45 ?m的滤膜清除杂质后，按照ELISA试剂盒说明进行操作，最后用酶标仪在波长450 nm下测定吸光值（OD）。通过建立标准曲线法确定沉默株系和野生型植株成熟叶片中的CTK含量。

1. 3 统计分析

利用Excel 2010对试验数据进行整理分析，采用SPSS 20.0进行方差分析，误差代表样本数为3时的标准误差，并以t分布进行检测。

2 结果与分析

2. 1 SlGT-33基因克隆及编码蛋白氨基酸序列分析结果

以番茄AC++的cDNA为模板扩增得到SlGT-33基因的ORF为1125 bp，共编码374个氨基酸残基，与已知番茄品种1706的同源基因序列（GenBank登录号XP004252336.1）（Yu et al.，2015）相比，仅在第61～63位少3个碱基，GenBank登录号为XP00425 2336.1。多重序列比对分析结果（图1）显示，SlGT-33蛋白含有Trihelix结构域[由第一、二和三螺旋（Helix）组成]、第四螺旋、中央结构域（Central domain）和核定位信号（NLS），且高度保守区位于序列上部。系统进化分析结果（图2）显示，SlGT-33（GenBank登录号Solyc12g043090）与SlGT-17（GenBank登录号Solyc-05g018350）聚类在同一分支上，二者氨基酸序列相似性最高，但仅为45.8%（表2），故推测SlGT-33蛋白具有特异性功能。

2. 2 SlGT-33基因组织表达特异性分析结果

由图3可知，SlGT-33基因除了在茎和成熟叶中的相对表达量无显著差异（P>0.05，下同）外，在其他组织中的相对表达量均存在显著差异（P<0.05，下同）;以在茎和成熟叶中的相对表达量较高，显著高于其他组织，其次是花和果实（绿色果实和红色果实），在根部的表达量最低，即SlGT-33基因具有组织表达特异性，且主要在茎和成熟叶中发挥其调控功能。

2. 3 SlGT-33基因在外源植物激素处理和非生物胁迫下的表达分析结果

由图4-A可知，经IAA、GA3和MeJA处理后，SlGT-33基因的相对表达量均与对照无显著差异，说明这些植物激素对SlGT-33基因的相对表达无显著影响;ACC处理4和24 h时SlGT-33基因的相对表达量较对照显著降低，推测ACC抑制SlGT-33基因表达。SlGT-33基因经ABA处理2～24 h时其表达量均显著高于对照，处理8 h时达最高值，说明SlGT-33基因表达受ABA诱导，可能是ABA响应基因。

由图4-B可知，SlGT-33基因在高盐胁迫和机械损伤下的相对表达量与对照无显著差异，推测高盐胁迫和机械损伤对SlGT-33基因表达无显著影响;高温胁迫和低温胁迫下，SlGT-33基因的相对表达量整体上呈逐渐降低变化趋势，尤其是低温胁迫下，SlGT-33基因表达降幅较大，在胁迫36 h时降至胁迫0 h的13.2%，推测极端温度抑制SlGT-33基因表达，尤其低温胁迫抑制效果更明显;在脱水胁迫下SlGT-33基因表达整体上呈逐渐升高的变化趋势，胁迫4～36 h时，SlGT-33基因的相对表达量均显著或极显著（P<0.01）高于对照，表明脱水胁迫可诱导SlGT-33基因表达。综上所述，SlGT-33基因属于环境敏感型基因，特别是对极端温度和脱水胁迫的响应最突出。

2. 4 SlGT-33-RNAi沉默株系鉴定结果

通過农杆菌介导转化法获得SlGT-33-RNAi沉默株系，利用qRT-PCR检测各沉默株系中SlGT-33基因的表达情况（图5），并与野生型进行比较，计算出沉默效率。结果显示，6个SlGT-33-RNAi沉默株系的沉默效率为64%～83%，其中以RNAi-13株系的沉默效率最高，其次是RNAi-4和RNAi-5株系。但由于RNAi-13株系未结出果实和种子。因此，选取RNAi-4和RNAi-5株系作为后续研究对象。

2. 5 SlGT-33-RNAi沉默株系幼苗表型观察结果

生长70 d的SlGT-33-RNAi沉默株系RNAi-4和RNAi-5幼苗株高均明显低于野生型（图6-A），虽然其复叶结构未发生改变，但整体尺寸明显变小（图6-B），且花序提前形成（图6-C），说明相同时间内SlGT-33-RNAi沉默株系的生长较对照快。进一步分析发现，SlGT-33-RNAi沉默株系的株高和节间长度为野生型的60%左右，均极显著低于野生型（图7）。可见，抑制SlGT-33基因表达会导致番茄幼苗矮化，但加速了生殖生长。

2. 6 SlGT-33基因下游基因在SlGT-33-RNAi沉默株系茎尖中的表达情况

植株矮化与茎尖生长点发育有关，因此本研究以茎尖为材料，检测SlGT-33基因下游基因的表达情况。由图8-A可知，IPT2和PHAN基因在2个SlGT-33-RNAi沉默株系的相对表达量均显著低于野生型，说明SlGT-33-RNAi株系矮化与IPT2和PHAN基因表达受抑制有关;KNOX2和WUS基因在SlGT-33-RNAi沉默株系的相对表达量显著高于野生型，说明沉默株系矮化与KNOX2和WUS基因高效表达密切相关;而KNOX1基因的表达与野生型无显著差异。由图8-B可知，SlGT-33-RNAi沉默株系茎尖组织的CTK含量显著低于野生型，说明抑制SlGT-33基因表达会导致CTK合成量减少，且抑制CTK关键合成酶基因IPT2和茎尖发育关键基因PHAN表达。

3 讨论

3. 1 SlGT-33-RNAi沉默株系幼苗矮化

本研究PCR扩增获得的SlGT-33基因ORF长度为1125 bp，编码374个氨基酸残基，与已知番茄品种1706的同源基因序列（XP004252336.1）（Yu et al.，2015）相比，在第61～63位少3个碱基，故少编码1个氨基酸（谷氨酸），但并未影响蛋白保守区结构，可能属于不同品种间的差异。通过qRT-PCR检测发现，SlGT-33基因在茎和成熟叶中的表达量较高，推测该基因调控番茄植株高生长。本研究通过RNAi技术抑制SlGT-33基因表达从而得到矮化的番茄植株，进一步佐证上述SlGT-33基因调控植株高生长的推论。前人则通过其他途径获得矮化的番茄植株，如Bishop等（1996）通过细胞色素P450基因突变获得番茄矮化株;Li等（2019）通过超表达MADS-box转录因子基因SlMBP9、Sun等（2020）通过抑制YABBY2b基因的表达分别实现番茄植株矮化;Tomlinson等（2019）通过阻止赤霉素途径抑制因子DELLA蛋白的降解也获得番茄矮化植株，但通过Trihelix家族SIP1亚家族基因获得番茄矮化植株的报道还较少见。

3. 2 SlGT-33-RNAi沉默株系矮化与激素调控密切相关

本研究发现，SlGT-33基因表达可被外源ABA和脱水胁迫诱导，但受极端温度抑制，故推测该基因为ABA响应基因。但大量研究证实，极端温度与植物体内的ABA含量呈正相关（Toh et al.，2008;Bi et al.，2020），说明SlGT-33基因调控机制极其复杂。另外，ABA与CTK间存在拮抗作用（Zhai et al.，2020），ABA和CTK同时受抑制的分子机理尚未明确 （Nishiyama et al.，2011）。本研究发现， 在SlGT-33-RNAi沉默株系中SlGT-33基因表达受到抑制，导致CTK合成量同步减少，与上述研究结果存在差异。因此 SlGT-33作为转录因子，其调控网络与调控机制还有待深入研究。

3. 3 SlGT-33-RNAi沉默株系矮化與茎尖组织相关

植株矮化通常与茎的顶端分生组织生长相关。顶端分生组织（SAM）由中心区（CZ）、外围区（PZ）和髓状分裂区（RM）3个功能区组成。通过调控SHOOT MERISTEMLESS（STM）基因的表达，可改变CZ区的细胞代谢（Yanai et al.，2005），进而改变茎尖发育。本研究中，STM基因的番茄同源基因KNOX2在SlGT-33-RNAi沉默株系茎尖组织中的相对表达量显著高于野生型，且Jasinski等（2007）研究证实，STM基因超表达后可增加植株叶片的数量。因此，推测SlGT-33-RNAi沉默株系花序提前形成与叶片加快形成有关。而SlGT-33-RNAi沉默株系复叶变小的原因可能与PHAN基因表达受抑制有关，因为抑制PHAN基因表达会减小番茄叶片的尺寸（Zoulias et al.，2012）。另外，WUS基因在SlGT-33-RNAi沉默株系茎尖组织的相对表达量显著高于野生型，推测SlGT-33-RNAi沉默株系顶端分生组织CZ区的生长受到干扰（Yadav et al.，2011）。在拟南芥中激活STM可促进CTK合成（Yanai et al.，2005），而本研究发现SlGT-33-RNAi沉默株系体内KNOX2基因表达上调，但CTK合成量减少， IPT2基因的表达也受到抑制，具体分子机理有待深入研究。

4 结论

SlGT-33基因属于环境敏感型基因，其表达受ABA和脱水胁迫诱导，但受极端温度的抑制。抑制SlGT-33基因表达会导致番茄植株矮化，其作用机制与顶端分生组织的CTK合成受抑制、茎尖组织关键调控基因KNOX2、PHAN和WUS的异常表达密切相关。

参考文献：

崔宝禄，李纷芬，陈国平. 2020. 番茄复三螺旋基因响应外源激素和非生物胁迫的研究[J]. 西北植物学报，40（8）：1372-1379. doi：10.7606/j.issn.1000-4025.2020.08.1372.  [Cui B L，Li F F，Chen G P. 2020. Response of double trihelix genes to phytohormones and abiotic stress in tomato[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，40（8）：1372-1379.]

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（責任编辑 陈 燕）