草地早熟禾叶片表皮解剖结构与抗白粉病性的研究

朱 琨， 郑桂华， 刘丽杰， 周 璐， 李珊珊， 范震宇， 钟 玥， 尼 尼

(1. 齐齐哈尔大学生命科学与农林学院， 抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室， 黑龙江 齐齐哈尔161006；2. 哈尔滨远东理工学院， 黑龙江 哈尔滨 150000)

草坪业在构建山水林田湖草生命共同体和推动绿化城市发展进程中愈来愈受到重视。草坪面积的不断扩大和集约化管理程度的提高，使得病害成为影响草坪质量的重要因素之一[1]。无论冷季型草坪草或者暖季型草坪草建坪，白粉病都是草坪养护管理中的重点病害。白粉病主要危害叶片，导致新陈代谢异常，造成植株早衰和死亡[2]。

草地早熟禾(PoapratensisL.)作为重要牧草和观赏草品种，具有成坪快、绿期长等优点，被广泛种植于世界各地，在我国北方已成为草坪绿化的主要草种之一。当长时间遮荫或通风不足时，禾布氏白粉菌(ErysiphegraminisDC.ex Merat)的分生孢子常寄生于草地早熟禾叶表，叶肉细胞胞间有侵染菌丝，为形成叶表的串生分生孢子提供营养，使其感染白粉病。草地早熟禾的不同品种对白粉病的抗性存在差异[2]，选择抗病性能强的品种建植草坪可降低病害发生。已有学者对植物的抗病性研究发现，叶片结构和气孔形态指标与品种抗病性具有相关性，大多数学者认为叶片组织结构排列紧密、表皮厚、气孔密度小可有效抵御病菌入侵，提高植物抗病性[3-8]。草地早熟禾的抗旱性研究指出，茎解剖结构和叶表超微结构证实存在结构抗性，表皮细胞厚度、皮层厚度、木质部厚度、导管直径、维管束直径与抗旱性呈正相关性[9-10]。但对草地早熟禾叶片结构、气孔形态指标、乳突形态指标与白粉病抗性的关系至今鲜有文献报道。为此，本试验采用扫描电镜和石蜡切片技术，对具有不同白粉病抗性的草地早熟禾品种叶片表面结构和解剖结构进行比较研究，旨在阐明草地早熟禾叶片抗性结构与其对白粉病抗性的关系，为筛选草地早熟禾抗病品种防治白粉病提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

选取3个草地早熟禾品种，分别为‘午夜2号’(Poapratensis‘Midnight Ⅱ’)、‘四季青’(Poapratensis‘All Spring’)、‘超级哥来德’(Poapratensis‘Ever Glade’)为供试材料，草种均由北京克劳沃集团提供。病原菌为禾布氏白粉病菌(Erysiphegraminis)，在齐齐哈尔大学植物栽培实训基地采集并鉴定。

1.2 试验设计

选择饱满、健康的草地早熟禾种子，培养基质为园土∶珍珠岩∶蛭石=3∶1∶1，每个穴苗盘播种量为15 g·m-2，在25℃的温室栽培管理，光周期为光照16 h/黑暗8 h；光照强度为6 000 lx；相对湿度为50%。当苗长至30 d左右时，挑选长势一致的植株，移栽到花盆(直径20 cm，高15 cm)中，每盆20株，每个品种5盆，3次重复，随机排列。生长40 d后，将病叶上的白粉病菌孢子用毛笔轻轻刷入无菌水中，并向其中加入2%的吐温-20表面活性剂，然后进行喷雾接种。将配置好的孢子悬浮液均匀喷施在草地早熟禾叶片上，以叶面满是雾滴但不滴落为宜，接种10 d后进行病情调查和随机取样[2]。

1.3 观测方法

1.3.1病情调查 病情指数借鉴田丽波等[4]的方法测定并计算。病级标准为0级：无病斑；1级：少量细小模糊的白粉斑，病斑面积占整个叶面积的5%以下；3级：白粉层薄，病斑面积占整个叶面积的6%～10%；5级：白粉层较厚，病斑面积占整个叶面积的11%～20%；7级：白粉层厚，病斑面积占整个叶面积的21%～40%；9级：白粉层厚，病斑面积占整个叶面积的40%以上。

发病率(%)=发病叶片数/调差总叶数×100%

白粉病抗性评价指标参照董文科等[2]病情指数(Disease index，DI)划分为：免疫(Immunity，I)：DI=0；高抗(High disease resistance，HR)：050。

1.3.2解剖结构的观察 参照李波等[11]的方法，在种植2个月后，每个品种随机选取10盆，每盆各取 1片充分展开的第2功能叶，3个品种共取30个叶片，剪取叶片中间等宽部位，清水洗净。固定于FAA固定液中，梯度酒精脱水后浸蜡包埋，用Leica RM 2135石蜡切片机进行切片，番红-固绿对染，中性树胶封片，制成永久切片。各品种每次重复制3个样片，每个样片观察5个视野。将制片在J-FL50i55i型荧光显微成像系统下摄影并测量下列指标：上、下表皮细胞的厚度，厚壁组织长度，维管束面积。

1.3.3叶片表面扫描电镜观察 将展开的第2功能叶剪下，用蒸馏水冲洗后，在叶片中部切成长0.5 cm小段，分别投入含戊二醛固定液瓶固定。制片前用0.1M磷酸缓冲液漂洗1 h，并更换漂洗液3～4次，然后在0℃～4℃下50%→70%→80%→90%酒精逐级脱水，每次静止15 min，100%酒精洗脱2次，每次静止15 min，脱水后把样品浸入乙酸异戊酯中，室温放置30 min后，用临界点干燥器进行干燥，将干燥样品粘样喷金，在JSM-5610LV扫描电镜下，各品种每次重复制3个小段，每品种选取10个视野，每个视野中气孔和乳突观测的总样本量大致相等。观察并测量叶片的气孔和乳突的长度、宽度、密度等指标。

1.4 数据处理

SPSS 22.0数据处理软件进行数据统计和分析，采取单因素方差分析和Duncan’s检验法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同草地早熟禾品种抗白粉病性比较

3个草地早熟禾品种叶片喷雾接种后，对其发病率、病情指数、抗性等级调查统计，经分析后发现(见表1)，3个供试品种白粉病发病率差异显著(P<0.05)，发病率为18.08%～90.26%，‘午夜2号’发病率最低，其次为‘四季青’，‘超级哥来德’发病率最高；3个供试品种白粉病病情指数为9.73～68.76，‘午夜2号’病情指数最低，其次为‘四季青’，‘超级哥来德’病情指数最高；根据DI对白粉病抗性等级划分，‘午夜2号’为MR，‘四季青’为MS，‘超级哥来德’为ES。

表1 不同草地早熟禾品种抗白粉病性评价

2.2 不同草地早熟禾品种的叶表气孔比较

利用扫描电镜对草地早熟禾叶片进行表皮结构观察(图1)，气孔形状近长方形，气孔凹陷。由表2可知，3个草地早熟禾品种的气孔长度和气孔长宽比差异显著(P<0.05)，均为：‘午夜2号’(MR)<‘四季青’(MS)<‘超级哥来德’(ES)。

图1 草地早熟禾叶片表面气孔

表2 草地早熟禾叶片气孔各指标测定

2.3 不同草地早熟禾品种的叶片乳突比较

利用扫描电镜对草地早熟禾叶表结构观察(图2)，发现有一定数量的硅质乳突，呈圆柱状，先端急尖；‘午夜2号’的乳突最大，‘四季青’的乳突次之，‘超级哥来德’的乳突最小。由表3可知，3个草地早熟禾品种叶片的乳突密度和乳突宽度差异显著(P<0.05)，排列顺序为：‘午夜2号’>‘四季青’>‘超级哥来德’。

图2 草地早熟禾叶片表面乳突

表3 草地早熟禾叶片乳突各指标测定

2.4 不同草地早熟禾品种的叶片横切面结构比较

草地早熟禾的叶片均由表皮、叶肉和叶脉3部分组成。从叶片解剖结构观察(图3)可知，草地早熟禾各品种的叶片上、下表皮均由一层细胞构成；叶肉组织较简单，由一层围绕维管束排列的薄壁细胞组成；维管束均匀分布，周围有排列松散的叶肉细胞，维管束两端均有较发达的厚壁组织；在主脉附近分布大量水滴状的泡状细胞。

图3 草地早熟禾叶的解剖结构

由表4可知，3个草地早熟禾品种的叶片解剖结构各指标间存在差异，3个品种间上、下表皮厚度差异显著(P< 0.05)，从大到小依次为‘午夜2号’>‘四季青’>‘超级哥来德’。

表4 叶的解剖结构指标

3 讨论与结论

气孔是由一对保卫细胞构成的植物叶表皮上的开孔，可控制植物气体交换和水分蒸腾[12]。作为植物预先形成的天然开孔，气孔也是许多病原菌入侵的通道。就气孔密度与抗病性而言，不同学者持不同观点。李海英等[7]对大豆(Glycinemax(Linn.) Merr.)叶片结构与灰斑病抗性的研究结果表明，抗病品种叶片正面及叶片背面的气孔密度明显少于感病品种。但郑伟等[8]的研究却得到了截然相反的结论，苹果(MaluspumilaMill.)品种的抗白粉病性越强，叶片气孔密度越大。因为气孔是预先形成的防预体系，其主要防预机制是依靠自身结构及开闭运动来抵御病菌侵入，所以气孔的密度和大小与品种的抗病性可能具有一定的相关性[13]。而杜蕙等[9]对8个葡萄(VitisviniferaL.)品种的叶片表皮气孔与霜霉病的抗性研究中指出，气孔的密度及大小与霜霉病的抗性无直接关系。本试验通过室内接种发病试验发现，3个草地早熟禾品种对白粉病的抗性表现具有显著性差异，其中‘午夜2号’为MR，‘四季青’为MS，‘超级哥来德’为ES。3个草地早熟禾品种的气孔密度差异不显著，表明3个草地早熟禾品种的气孔密度与白粉病抗性无显著相关性，但3个草地早熟禾品种的气孔长度和气孔长宽比都具有显著性差异，表现为‘午夜2号’(MR)<‘四季青’(MS)<‘超级哥来德’(ES)。由此可知，3个草地早熟禾品种的气孔长度和气孔长宽比与白粉病抗性呈负相关性。造成这些差异的原因很可能是抗病性弱的草地早熟禾品种在白粉病菌的作用下，破坏了原生质结构，致使其通透性加大，导致其气孔长度和气孔长宽比加大[14]。

乳突是在长期进化的过程中形成的叶细胞表面凸起的特殊抗旱结构，有利于植物水分传导和吸收[15]。寇瑾[16]对丛藓科植物叶细胞表面乳突的光镜观察，得出乳突是叶表面的稳定结构，可借助其差异性对属间和种间的物种进行划分。当白粉病菌侵染后，寄主针对白粉病菌的入侵部位形成乳突，位于寄主细胞壁与质膜之间形状如乳头状的细胞壁沉积物[17]。马青等[18]研究发现经寡聚糖诱导后的黄瓜(CucumissativusLinn.)，主要通过细胞壁加厚和产生多层次结构的乳突，有效延迟和阻挡病原菌进入细胞，进而提高黄瓜对白粉菌的抗性。抗病品种形成的乳突致密度高，而感病品种形成的乳突致密度低[19]。本试验对叶表扫描电镜观察发现，3个草地早熟禾品种均有圆柱状、先端急尖的硅质乳突。显然，无论是抗病品种还是感病品种，受白粉病侵染均能形成乳突。3个品种的乳突长度差异不显著，但乳突密度与宽度均差异显著，大小顺序均为：‘午夜2号’(MR)>‘四季青’(MS)>‘超级哥来德’(ES)。可见，乳突越密越大，品种抗性越强。这与王彰明的研究结果相一致，即乳突密度与抗病性呈正相关，进一步推测乳突作为病菌侵染时的障碍，可有效地阻挡侵染或消耗侵染过程中能量物质[19]。

叶片解剖结构可以反映外界环境因子对植物的影响，以及植物自身对环境的适应[20]。国内外学者已通过叶表皮特征对不同植物进行系统分类学研究[21-24]。大量研究证实，叶片解剖结构对了解植物遗传基础差异具有重要意义[25-28]。叶片解剖结构与白粉病抗性也存在相关性，戎福喜等[29]对黄瓜叶片横切面显微形态组织结构观察中发现，突变体比野生型叶片上、下表皮细胞层均加厚，其对白粉菌抗性增强。田丽波等[4]研究表明，苦瓜(MomordicacharantiaL.)叶片下表皮厚度与白粉病抗性呈正相关。本试验中3个草地早熟禾品种叶片上、下表皮厚度依次为‘午夜2号’(MR)>‘四季青’(MS)>‘超级哥来德’(ES)。这与上述学者的研究结果相一致，可见，叶片表皮细胞可抵御病菌入侵，其厚度增加有利于提高白粉病抗性[4]。

综上所述，草地早熟禾叶片表面结构和解剖结构与抗白粉病有关，其气孔长度、气孔长宽比、乳突密度、宽度、叶片上、下表皮厚可作为评价草地早熟禾抗白粉病较理想的指标。抗性品种表现出气孔长度小，气孔长宽比小，上下表皮厚度大，且表皮上分布的乳突密而大等防御白粉病菌侵染的结构特点。