独活寄生汤对肝肾不足寒湿痹阻型类风湿性关节炎Th17/Treg 平衡的影响∗

赵海燕，张鸿婷，郭丹丹，张秀荣

黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150000

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是临床常见的自身免疫性疾病，以关节滑膜慢性炎症、血管翳形成、软骨及骨组织的破坏为主要特征［1］。近年随着CD4+T 细胞中辅助性T 细胞（T helper cells，Th）的发现及对其在RA 中作用研究的不断深入，辅助性T 细胞17（T helper cell 17，Th17）的促炎作用和调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg）的抑炎作用以及Th17/Treg的平衡与RA 的密切关系越来越受到研究者的重视，以Th17/Treg 作为靶点治疗RA 进一步推动了对其发病机制的研究步伐，成为现阶段研究的一项热点［2］。现已证实RA 患者外周血中Treg 细胞数量减少、功能下降，Th17/Treg 比值升高，且与疾病活动度相关［3］，因此调节Th17/Treg平衡是治疗RA 的有效方法。独活寄生汤源自《备急千金要方》，目前广泛用于治疗关节疼痛，本研究以Th17/Treg 平衡为靶点，观察独活寄生汤对中、重度RA的临床疗效并探索其作用机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料选择2018年11月至2019年6月在黑龙江中医药大学附属第二医院风湿科门诊就诊的RA患者50例，按照随机数字分组法分为观察组和对照组，每组25 例，研究过程中每组失访1例。观察组中男6例，女18例；平均年龄（53.17±10.11）岁；平均病程（29.76±11.49）个月。对照组中男5 例，女19 例；平均年龄（52.87±10.07）岁；平均病程（30.07±11.10）个月。两组患者一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 纳入标准纳入：1）符合2010 年美国风湿病学会（American college rheumatology，ACR）和欧洲抗风湿病联盟（European league against rheumatism，EULAR）的RA诊断标准［4］且参照《中药新药临床研究指导原则（试行）》［5］辨证为肝肾不足寒湿痹阻型者；2）年龄18～65 岁者；3）符合活动期RA 诊断标准，且病情评价（DAS28 评分）［6］＞3.2 者；4）本研究经医院伦理委员会批准，符合知情同意原则且签署知情同意书者。

1.3 排除标准排除：1）合并其他风湿病者，如系统性红斑狼疮、干燥综合征、严重膝骨关节炎；2）合并严重心脑血管疾病，造血系统、内分泌等严重原发性疾病，精神病者；3）肝肾功能异常者；4）对试验药物（包括基础用药、合并用药）过敏，或过敏体质（对2 种及以上药物过敏）者；5）妊娠和准备妊娠的妇女、哺乳期妇女；6）合并各种急慢性传染性疾病者；7）4 周内使用过糖皮质激素或接受生物制剂治疗者。

1.4 治疗方法1）对照组根据病情规范应用西医抗风湿药物，包括非甾体抗炎药和免疫抑制剂。2）观察组在西医规范治疗基础上服用独活寄生汤，药物组成：独活15 g，桑寄生25 g，秦艽15 g，防风15 g，细辛5 g，生地黄15 g，当归15 g，川芎15 g，白芍20 g，怀牛膝20 g，肉桂10 g，茯苓15 g，杜仲25 g，党参10 g，甘草10 g。水煎服，每日1剂，水煎300 mL，分早晚两次温服，每次150 mL。两组疗程均为24周。

1.5 观察指标

1.5.1 疗效指标 记录治疗前后关节压痛数（trajectory chart，TJC）、关节肿胀数（swollen joint counts，SJC）、晨僵时间、中医证候积分、双手平均握力、视觉模拟评分（visual analogue score，VAS）。

1.5.2 实验室指标 治疗前后采集患者外周血：1）采用酶联免疫吸附法检测白细胞介素17（interleukin-17，IL-17）、白细胞介素10（interleukin-10，IL-10）、转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）水平（试剂盒购自中国的万类生物公司），严格按照试剂盒说明书操作，酶标仪450 nm读取吸光值，按曲线方程计算各样本浓度值。2）采用流式细胞仪测定Th17、Treg 细胞比例：读取CD4+、IL-17 细胞在CD4+T 细胞中的百分比及CD4+、CD25+、Foxp3+、Treg 细胞在CD4+T 细胞中的百分比，并计算Th17/Treg 比值（试剂盒购自美国的Thermo 公司及中国的索莱宝公司）。3）采用免疫印迹法测定叉头状转录因子P3（forkhead transcription facter 3，p-Foxp3）及其磷酸化翼状头转录因子P3（forkhead transcription facter 3，p-Foxp3）表达水平［材料购自wanleibio 公司（产地中国）及Abgent 公司（产地中国）］，散射比浊法测定血C 反应蛋白（Creactive protein，CRP），魏氏法测定ESR水平。

1.5.3 安全性指标 检测患者治疗前后血、尿常规，肝肾功能，心电图。

1.6 统计学方法采用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析，计量资料以表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 疗效指标TJC、SJC、晨僵时间、中医证候积分、VAS 评分，两组治疗后均明显低于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.01）；观察组上述指标较对照组改善明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组治疗前后疗效比较（）

表1 两组治疗前后疗效比较（）

注：与同组治疗前比较，*表示P＜0.01；与对照组治疗后比较，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

2.2 ESR、CRP、IL-17、IL-10 及TGF-β 水平治疗后，两组ESR、IL-17 水平均明显降低，IL-10、TGFβ水平均明显升高，组内比较差异有统计学意义（P＜0.01）；观察组ESR、IL-17 及CRP 降低较对照组明显（P＜0.01），IL-10、TGF-β较对照组升高显著（P＜0.05）。见表2。

表2 两组治疗前后ESR、CRP、IL-10、IL-17、TGF-β水平比较（）

表2 两组治疗前后ESR、CRP、IL-10、IL-17、TGF-β水平比较（）

注：与同组治疗前比较，*表示P＜0.01；△表示与对照组治疗后比较，P＜0.05

2.3 Th17、Treg 细胞表达水平治疗后，两组Th17 细胞百分比及Th17/Treg 比值均显著降低，而Treg 细胞百分比显著升高，组内比较差异有统计学意义（P＜0.05）。观察组上述指标较对照组改善显著（P＜0.05）。见表3。

表3 两组治疗前后Th17/Treg细胞表达水平比较（）

表3 两组治疗前后Th17/Treg细胞表达水平比较（）

注：与同组治疗前比较，*表示P＜0.01；与对照组治疗后比较，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

2.4 Th17、Treg 细胞表达的典型病例观察组1例患者治疗前Th17 在CD4+T 细胞中的含量是18.34%，对照组1例患者治疗前Th17在CD4+T细胞中的含量是17.30%，与正常对照者（9.08%）比较均明显升高，观察组治疗后Th17 在CD4+T 细胞中的含量是13.44%，对照组疗后是14.09%，观察组较对照组治疗后Th17细胞降低的更明显，见图1。观察组1 例患者治疗前Treg 在CD4+T 细胞中的含量是4.26%，对照组1 例患者治疗前Treg 在CD4+T细胞中的含量是4.81%，与正常对照者（12.39%）比较均明显降低，观察组治疗后Treg 在CD4+T 细胞中的含量是8.37%，对照组疗后是6.56%，观察组较对照组Treg 细胞治疗后升高的更明显。见图2。

图1 Th17（CD4+、IL-17+，%）在CD4+T细胞中的表达

图2 Treg（CD4+、CD25+、Foxp3+，%）在CD4+T细胞中的表达情况

2.5 Treg 细胞Foxp3 及其p-Foxp3 表达的典型病例免疫印迹法显示，两组治疗前Treg 细胞Foxp3、p-Foxp3 的蛋白表达量与正常对照组比较均降低；两组治疗后Treg 细胞Foxp3、p-Foxp3 的蛋白表达量均较治疗前所增高，且观察组增高更明显。见图3。

图3 患者外周血Treg细胞Foxp3、P-Foxp3的蛋白表达

2.6 安全性评价两组患者治疗前后血、尿常规，肝肾功能及心电图无明显异常改变，治疗过程中无不良反应发生。

3 讨论

RA 属于中医“痹证”范畴，多因正气不足，外邪乘虚而入，致使肌肉、筋骨的气血运行受阻而致痹。现代医学认为，RA 为自身免疫性疾病，其发病机制与淋巴细胞免疫失调及其产生的大量相关炎性细胞因子在患者滑膜组织中浸润有关［7］，已证实RA 在疾病的进程中Th17 与Treg 细胞呈现失衡状态［8］。Th17 细胞是一种能够在核转录因子RORγt 调控下特异分泌IL-17 的CD4+T 细 胞［9］。Th17 细胞通过产生IL-17 来激活巨噬细胞、树突状细胞、滑膜细胞等，并分泌基质金属蛋白酶破坏骨和软骨组织［10-11］。有研究显示［12］，RA 患者血清及关节液中IL-17 的表达明显升高，促进滑膜细胞分泌多种炎性细胞因子，抑制软骨细胞合成基质和胶原，增强破骨细胞活性，引起骨侵蚀。而Treg 是一种具有免疫抑制活性的CD4+T 细胞亚群，Treg 细胞通过释放细胞因子IL-10 和TGF-β发挥抑制T 细胞及抗原呈递细胞的功能，降低炎性细胞因子的产生及抗体分泌而发挥免疫效应。Foxp3 是Treg 重要转录因子，其持续表达是维持Treg 抑制活性的关键因素。初始CD4+T 细胞在TGF-β的单独诱导下，可以分化为Treg 细胞，当IL-6 同时存在时，能够诱导RORγt 的表达，抑制Treg 细胞产生，促进初始CD4+T 细胞分化成Thl7细胞［13］。本研究显示RA 患者外周血中Th17 细胞的含量及IL-17 的表达水平明显升高与疾病活动度正相关，与既往研究［14］一致；而RA 炎症关节的细胞因子环境抑制了Treg的活性，Treg相关细胞因子IL-10和TGF-β相应减少，致使抑制自身免疫反应作用降低，导致炎症及骨破坏加重［15］。本研究发现独活寄生汤联合西药治疗后患者循环血中Th17细胞数量显著降低，而Treg细胞数量及其相关因子IL-10、TGF-β的表达明显增加，优于单纯西药组，且Treg 的转录因子p-Foxp3 表达较疗前增强，说明独活寄生汤联合西药治疗能够抑制Th17细胞分化，增强Treg的活性，调节体内Th17/Treg 平衡，调控炎症因子的表达，从而调节体内异常免疫反应。

综上所述，独活寄生汤联合西药治疗可以改善肝肾不足寒湿痹阻型RA 患者临床症状及控制关节炎症，其作用机制是通过下调Th17 细胞含量，上调Treg 细胞含量，调节Th17/Treg 细胞平衡，抑制炎性因子的释放，促进体内免疫细胞的平衡，从而控制RA的病情恶化。