水稻芽期耐寒性综合评价及耐寒指标筛选

金 明 刘旭升 逄洪波* 王 泽 赵宗耀 韩康顺 李彦利 贾玉敏

(1.沈阳师范大学 生命科学学院，沈阳 110034；2.通化市农业科学研究院 水稻所，吉林 通化 135007)

水稻是最重要的粮食作物之一，全世界一半以上的人口以水稻为主食[1-2]。冷害是导致水稻产量下降的主要因素之一，全球大约1 500万hm2的土地容易遭受冷害，在日本、韩国、中国的东北和西南地区尤为严重[3-4]。水稻直播有利于机械化操作，具有省工、省力和高效等优势，随着劳动力成本不断上涨，水稻直播越来越受到农民的青睐[5]。芽期是水稻生长发育过程中最脆弱的时期，直播的水稻种子遭受冷害会引起种子死亡，大大降低发芽率，导致不正常幼苗的形成，最终造成严重减产[6-7]。故提高芽期耐寒性是水稻育种的重要目标，芽期耐寒性强的水稻品种将有利于粮食生产，促进粮食安全和持续发展。

水稻芽期分为萌发期和芽期2个阶段。萌发期耐寒性是指水稻种子在低温下的发芽能力，而芽期耐寒性是指水稻种子萌发后在低温下成苗的能力[8]。国内外学者在水稻芽期耐寒筛选和鉴定方面已经开展了一些相应的研究，韩龙植等[9]以成苗率作为芽期耐寒指标从879份水稻种质资源中筛选出39份芽期耐寒性极强的水稻种质资源。王丽艳等[10]以发芽率等4个指标对8个水稻品种和3个自育品系进行评价筛选出‘垦粳8’和‘鸿源香169’2个耐寒性强的水稻品种。黄永兰等[11]以死苗率作为芽期耐寒性评价指标对江西省的48份早稻品种进行评价，得出杂交水稻品种强于常规水稻品种的结论。唐双勤等[12]以成苗率及根长、根数等指标作为芽期耐寒指标对江西省的33份早籼杂交稻品种和8份常规稻进行评价筛选出‘陵两优7108’、‘两优287’和‘锦两优816’等9份强耐寒品种。熊英等[13]以成苗率和6个幼苗生长相关指标作为芽期耐寒性的评价指标对204份水稻材料进行评价，筛选出了5份耐寒能力突出的水稻种质。肖宇龙等[14]以成苗率作为芽期耐寒指标对江西省23个早稻主栽品种组合进行评价，筛选出4个芽期耐寒性极强的组合。张建华等[15]以幼芽成活率作为芽期耐寒指标对690份稻种资源进行评价筛选出25份强耐寒品种。

已有研究中，水稻萌发期和芽期耐寒性主要分别采用发芽率和成苗率进行评价[3,16-17]。QTL定位研究结果发现，萌发期和芽期耐寒性的QTL位点只有少部分重叠，说明二者的耐寒机制可能存在较大差异[18]，而水稻耐寒性是由多个因子共同决定的复杂数量性状，因此仅采用单一指标进行耐寒性评价有局限性。且以往研究利用统计学方法对水稻芽期耐寒性进行评价时，一般只采用单一方法进行简单分析，利用多元统计方法对水稻芽期耐寒性进行综合评价鲜见报道。故本研究通过测定萌发期指标(发芽率、发芽势、相对发芽率、相对发芽势、发芽指数、种子萌发指数、平均发芽时间和萌发系数)与芽期指标(成苗率)，采用主成分分析法和隶属函数法，对49个水稻种质进行综合评价，旨在筛选出合理的芽期耐寒性相关评价指标，建立更加快速准确的芽期耐寒评价体系，以期为水稻种质资源的耐寒评价和选育耐寒性优异的水稻新品种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究选用的49份水稻种质资源来源于中国、孟加拉国和印度等10个不同国家，种质的具体信息见表1。

表1 49份水稻种质资源名称及其来源Table 1 Names and origin of 49 rice germplasm resources

1.2 试验方法

种子置于50 ℃ 烘箱中72 h打破休眠后，75%乙醇对其表面进行消毒处理，并用无菌水冲洗3次[19]。

发芽率测定参考Fujino等[16-17]和Li等[20]的方法，每个水稻品种挑选40粒饱满种子放置于铺有双层滤纸的玻璃培养皿(直径9 cm)中，加入适量无菌水后，在气候培养箱15 ℃(12 h光照/12 h黑暗)中低温处理10 d。种子露白则记为发芽，统计每天发芽种子个数用于萌发期相关耐寒指标的计算。每个品种重复3次。

成苗率测定参考Zhang等[3]和Pan等[21]的方法，将水稻种子放置于28 ℃黑暗条件下浸种48 h后，放入30 ℃培养箱黑暗条件下催芽24 h。选择40粒芽长约5 mm的水稻种子，转移到培养皿中后放入5 ℃ 气候培养箱(12 h光照/12 h黑暗)低温处理10 d，转至培养室(28 ℃，12 h光照/12 h黑暗)恢复生长。7 d后统计成苗数。每个品种重复3次。

1.3 测定指标

以发芽率(GR， germination rate)、发芽势(GP， germination potential)、相对发芽率(RGR， relative germination rate)、相对发芽势(RGP， relative germination potential)、发芽指数(GI， germination index)，种子萌发指数(PI， promptness index)、平均发芽时间(MGT， mean germination time)、萌发系数(GC， germination coefficient)以及成苗率(SR， seedling rate)作为芽期耐寒性的评价指标，对不同品种水稻的芽期耐寒性进行评价。各指标的计算公式如下：

发芽率=(发芽的种子数/种子总数)×100%

(1)

发芽势=(培养4天发芽的种子数/
种子总数)×100%

(2)

相对发芽率=处理发芽率/对照发芽率×100%

(3)

相对发芽势=处理发芽势/对照发芽势×100%

(4)

发芽指数=∑(Gt/Dt)

(5)

式(5)中:Gt,第t天种子的发芽数；Dt，进行发芽实验的第t天。

种子萌发指数=1.00×nd2+0.75×nd4+
0.50×nd6+0.25×nd8

(6)

式(6)中:nd2、nd4、nd6和nd8分别对应第2 天、第4 天、第6天和第8天的发芽率。

平均发芽时间=(G1T1+G2T2+…+GnTn)/
(G1+G2+…+Gn)

(7)

式(7)中:Tn指代发芽日数，d;Gn是与发芽日数相对应的发芽种子数。

萌发系数=发芽率/平均发芽时间

(8)

成苗率=(成活苗数/出芽总粒数)×100%

(9)

1.4 数据处理及统计分析

利用Excel 2016软件进行各综合指标耐寒隶属函数值及芽期耐寒综合评价值的计算。

u(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(10)

(11)

(12)

式(10)～(12)中：j取1到n的值；Xj和u(Xj)分别代表第j个综合指标的主成分值和隶属函数值；Xmax和Xmin分别表示第j个主成分的最大值和最小值[22]；Wj，第j个综合指标在所有综合指标中的重要程度即权重；Pj，通过主成分分析后所得的第j个综合指标的贡献率[23]；D，为水稻品种在低温条件下由综合指标计算所得的耐寒综合评价值[24]。

利用SPSS 26.0软件进行主成分分析等统计学相关分析。

2 结果与分析

2.1 各指标之间的相关性分析

由表2可知，发芽率与发芽势、相对发芽势呈显著正相关，与相对发芽率、种子萌发指数、发芽指数和萌发系数呈极显著正相关，其中发芽率与萌发系数的相关系数最大，R2=0.998；平均发芽时间与发芽率、相对发芽率、发芽势、相对发芽势、种子萌发指数、发芽指数和萌发系数均呈极显著负相关，其中平均发芽时间与种子萌发指数的相关系数绝对值最大,为0.941；而成苗率与其余几个指标的相关性不显著。相关性分析结果表明，大部分单项指标间都呈极显著相关性。

表2 水稻芽期耐寒性指标的相关系数Table 2 Correlation coefficient of cold tolerance indexes in rice at the germination stage

2.2 主成分分析

由表3可知，9个芽期耐寒指标通过主成分分析后得到了2个主成分。其中主成分1的特征值为6.370，具有70.782%的贡献率；而主成分2的特征值为1.558，具有17.310%的贡献率。2个主成分的累积贡献率为88.092%，特征值均>1，依据累计贡献率≥85%，特征值>1的提取标准，舍弃其余特征值<1的综合指标，故将9个芽期耐寒指标转化为 2个独立的综合指标，这2个综合指标能够对原有单项指标的大部分信息进行足够的概括，可以用于水稻种质资源的芽期耐寒性表型指标评价。主成分1中系数较大的为发芽指数(GI)0.390，种子萌发指数(PI)0.388，萌发系数(GC)0.380，平均发芽时间(MGT)-0.379，发芽率(GR)0.373和相对发芽率(RGR)0.372，系数的绝对值均>0.3；主成分2中系数最大的为相对发芽势(RGP)0.612。由表3可得到2个综合指标的对应系数为:

表3 主成分贡献率及特征向量Table 3 Principal component contribution ratio and eigenvector

主成分1： CI1=0.373GR+0.248GP+0.388PI+0.390GI-0.379MGT+0.380GC-0.099SR+0.372RGR+0.248RGP

主成分2： CI2=-0.233GR+0.610GP-0.008PI-0.073GI-0.017MGT-0.196GC+0.322SR-0.226RGR+0.612RGP

2.3 品种综合评价

由表4可知，主成分1中，IRIS 313-11965的隶属函数值最大，为 1.000，表明IRIS 313-11965在主成分1中的芽期耐寒性最强，而IRIS 313-10930的隶属函数值最小，为0.000，表明IRIS 313-10930在主成分1中的芽期耐寒性最弱；主成分2中，IRIS 313-10946的隶属函数值最大，为 1.000，表明IRIS 313-10946在主成分2中的芽期耐寒性最强，而IRIS 313-10963的隶属函数值最小，为0.000，表明IRIS 313-10963在主成分2中的芽期耐寒性最弱。

依据公式(11)计算得到主成分分析筛选出的2 个综合指标的权重。主成分1的权重为0.803，主成分2的权重为0.197。在49个水稻品种中，IRIS 313-11965、IRIS 313-8956 和 IRIS 313-11038的D值较高(0.790～0.830)，评价为芽期耐寒能力极强。IRIS 313-10891、IRIS 313-9405和IRIS 313-10071等9个品种的D值较低(0.187～0.282)，评价为芽期耐寒能力极弱，见表4。

表4 各品种的主成分值、隶属函数值、综合评价值(D)和预测值Table 4 Principal component value, membership function value, comprehensiveevaluation value and predicted value of each variety

表4(续)

2.4 回归分析

将D作为因变量，9个单项指标作为自变量进行逐步回归分析，建立最优回归方程：D=0.326+0.020GI+0.021SR-0.028MGT+0.025PI+0.012GR+0.137RGP。决定系数R2=1.000，P=0.000，6个自变量几乎可决定D的全部变异，分别是发芽指数(GI)、成苗率(SR)、平均发芽时间(MGT)、种子萌发指数(PI)、发芽率(GR)和相对发芽势(RGP)。用该回归方程对49个品种水稻芽期耐寒性进行预测，其预测值与综合评价值D的排序完全一致(表4)，说明该回归方程可对水稻芽期耐寒性进行准确的预测。

2.5 聚类分析

利用D，采用组间联接法和欧氏距离进行聚类分析，在欧氏距离8.0处将49份品种分为5个类群,见图1，对应水稻耐寒性划分的极强、强、中、弱和极弱 5个等级。第Ⅰ类群包括IRIS 313-11986、IRIS 313-11031和IRIS 313-11154等13个水稻品种，耐寒性弱；第Ⅱ类群包括IRIS 313-11049、IRIS 313-10932和IRIS 313-11048等7个水稻品种，耐寒性中等；第Ⅲ类群包括IRIS 313-11965、IRIS 313-8956 和 IRIS 313-11038共3个水稻品种，耐寒性极强；第Ⅳ类群包括IRIS 313-11944、IRIS 313-11016和IRIS 313-10731等17个品种，耐寒性强；第Ⅴ类群包括IRIS 313-10891、IRIS 313-9405和IRIS 313-10071等9个水稻品种，耐寒性极弱。

Ⅰ，耐寒性弱；Ⅱ，耐寒性中等；Ⅲ，耐寒性极强；Ⅳ，耐寒性强；Ⅴ，耐寒性极弱。虚线表示欧式距离8。Ⅰ， weak cold-tolerant varieties; Ⅱ， moderate cold-tolerant varieties; Ⅲ， particularly strong cold tolerance; Ⅳ， strong cold tolerance; Ⅴ， particularly weak cold tolerance. The dotted line indicates that Euclidean distance value is 8.图1 基于9个芽期耐寒指标的49份水稻种质资源聚类分析Fig.1 Cluster analysis results of 49 rice germplasm resources based on 9 cold tolerance indexes at the germination stage

3 讨 论

耐寒种质资源的筛选和鉴定是培育耐寒水稻品种的直接有效手段。随着机械化生产和直播稻面积的大量增加，水稻芽期耐寒性变得尤为重要。以往的研究多选用发芽率[10]、成苗率[9,12-13,15]、发芽指数[10]和根长[12-13]等指标评价水稻芽期耐寒性，但水稻耐寒性是由多个因子共同决定的复杂数量性状，仅使用某一个单项指标对其进行耐寒性鉴定评价具有局限性[25-26]，故本研究通过利用萌发期耐寒指标(发芽率、发芽势、相对发芽率、相对发芽势、发芽指数、种子萌发指数、萌发系数和平均发芽时间)和芽期耐寒指标(成苗率)共9个指标进行综合评价。

主成分分析可以将多个关联的单项指标转化成数量很少并且相互独立的综合指标，避免了多指标评价中各指标间具有一定相关性且信息重叠等问题。这种方法已经用于农艺性状的评价中，如高粱耐盐性[27]、大豆耐低磷[28]、小麦抗旱性[29]和水稻耐盐性[30-31]等。本研究计算出每个水稻种质的主成分值及对应的隶属函数值和权重，避免人为确定权重的主观性；将2个综合指标的特征向量进行归一化处理，得到水稻芽期耐寒性的综合评价值(D)，这样既考虑了各指标间的相关性，又考虑了各指标的重要性，从而使获得的评价结果更为科学合理。利用多元统计学分析进行综合评价将9个芽期耐寒性指标数量化，与芽期耐寒性强弱建立数量关系，根据D对本研究的49个水稻品种芽期耐寒性进行排序以及分级，结果表明，IRIS 313-11965、IRIS 313-8956和IRIS 313-11038共3个水稻种质的芽期耐寒性在选取的49个水稻品种中最强，可以在今后的水稻芽期耐寒品种选育和改良中加以应用。

聚类分析可以将不同的种质进行准确的分类，能够直观地对不同种质间的分类关系进行分析[32]。本研究中，根据D对49个水稻品种进行聚类分析，将其划分为5个类别，与韩龙植等[9]研究中极强、强、中、弱和极弱的5个水稻耐寒等级划分一致。本研究利用逐步回归分析构建了1个最优回归方程作为水稻芽期耐寒性的评价模型，利用该模型得到的预测值及排序都与利用D进行评价的结果基本相同。结果验证了利用该模型评价水稻芽期耐寒性比较可靠，其评价指标容易测定且准确有效，可以用于预测目标种质芽期耐寒性的强弱。

4 结 论

本研究对49份水稻种质资源的芽期耐寒性进行综合评价。利用主成分分析、隶属函数分析、聚类分析和逐步回归分析等多元统计学方法，从测定的9个单项指标中筛选出发芽率(GR)、相对发芽势(RGP)、发芽指数(GI)、种子萌发指数(PI)、平均发芽时间(MGT)和成苗率(SR)6个与水稻芽期耐寒性有显著相关的关键指标，建立了最优回归方程，D=0.326+0.020GI+0.021SR-0.028MGT+0.025PI+0.012GR+0.137RGP可用于水稻种质资源芽期耐寒性的快速鉴定与预测。利用综合评价值(D)筛选出3份芽期耐寒性极强的水稻种质材料是IRIS 313-11965、IRIS 313-8956和IRIS 313-11038。