HPLC法测定动物源性食品中抗生素残留的前处理技术研究现状

朱虹

【关键词】动物源性食品;抗生素;残留检测;前处理技术

【中图分类号】TS207.5 【文献标识码】A 【文章编号】1674-0688（2021）06-0050-03

0 引言

随着人们生活水平的日益提高，肉食成为人們餐桌中不可缺少的食品，但是动物在饲养过程中常常会使用一些抗生素，于是不可避免地造成动物源性食品中的抗生素残留，而人们长期不断地摄入残留的抗生素，导致抗生素在体内积蓄、造成抗药性或诱导其他疾病等问题[1]。因此，动物源性食品的质量安全问题必须引起重视，能快速、简便、低成本地对动物源性食品抗生素残留进行检测，是当下亟待解决的问题。

抗生素残留分析一般包括样品前处理和检测两个部分。抗生素残留的检测方法有高效液相色谱法（HPLC）、质谱法（MS）、液质联用技术（HPLC-MS）、气质联用技术（GC-MS）、免疫法等。其中，最常用的检测方法是高效液相色谱法（HPLC）和液质联用技术（HPLC-MS），用这两种方法进行检测之前都需要进行样品前处理。样品前处理是抗生素检测技术的关键，直接影响到分析检测的准确度、成本和检测效率。因此，寻找简便、有效、低成本的样品前处理技术势在必行。

1 样品前处理技术

近年来，人们对动物源性食品中抗生素残留的前处理技术的研究取得了较大进展，以下对常用的样品前处理方法进行介绍，并对每种前处理方法的特点进行总结。

1.1 液-液萃取（LLE）

液-液萃取[2]是利用相似相溶原理，基于待测物在不同溶剂间的分配系数不同，采用合适的溶剂作为萃取剂，经过匀浆、振摇、离心等步骤，将待测物转移到萃取剂中而实现分离的样品前处理方法。

马俊美等人[3]用超高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS）检测猪肉中9种大环内酯类抗生素，用乙腈重复进行液-液萃取，浓缩后，用0.1%甲酸溶液-甲醇溶解残渣后，进行UPLC-MS测定，结果表明，9种待测抗生素在0.5～100 ng/mL范围内线性关系良好;定量限范围在0.1～0.4 μg/kg;加标量为0.1～4.0 μg/kg时，方法回收率在69.4%～107.6%。

此方法操作简单，对试验条件和仪器要求不高，但步骤烦琐、耗时，并使用大量具有毒性的有机溶剂，不利于健康、环保、安全，且样品干扰物质含量较高时往往达不到理想的萃取效果。

1.2 微波辅助萃取（MAE）

微波辅助萃取[4]是微波与传统溶剂提取法相结合的一种新型前处理技术。该方法是在微波作用下，选择合适的溶剂，对目标物进行选择性萃取的前处理方法。

ZHANG等人[5]建立了运用微波辅助萃取技术对鱼肉进行前处理，通过液相色谱-串联质谱法同时检测鱼肉中含5种大环内酯类抗生素在内的54种药物，检出限为0.01～0.50 μg/kg，回收率为56.3%～119.9%，相对标准偏差为0.3%～17.1%。

微波辅助萃取法具有效率高、速度快、溶剂消耗量少、操作简单等优点。但是在实验过程中，应注意控制萃取的温度和时间，否则温度过高或过长容易造成目标物的分解而降低回收率。

1.3 加压液体萃取法（PLE）

加压液体萃取技术[6]是一种将高温高压条件与溶萃取剂相结合，对固体或半固体样品进行萃取的前处理方法，高温高压下萃取剂的黏度低、溶解能力高，可以使待测物从基质中加快解析进入萃取剂中。

Jim é nez等人[7]对鸡蛋中41种抗生素残留进行测定，在70 ℃下，用乙腈和丁二酸缓冲液（pH6.0）按1∶1混合进行PLE，萃取后直接进行UPLC-MS/MS分析，精密度在10%～20%。

Andreas等人[8]开发了一种检测肉制品中的伊维菌素B1的含量，用95%甲醇-5%水作为萃取剂，120 ℃、10 MPa提取10 min，提取液经SPE柱净化，通过HPLC检测，回收率接近于100%。

该方法相较于传统的液-液萃取技术，可实现自动化萃取，萃取时间缩短，萃取溶剂使用量减少，进而降低了环境污染，但此方法对仪器设备有一定的要求。

1.4 固相萃取（SPE）

固相萃取[9]是一种基于液-固分离萃取的样品预处理技术，利用固体吸附剂吸附溶液中的待测物，使待测物与样品基体和干扰物质分离，再用洗脱液洗待测物。常用的固相萃取填料有硅胶、氧化铝等。固相萃取有离线技术和在线技术，在线固相萃取可直接与HPLC、HPLC/MS等连接。

陈毓芳[10]建立了肌肉组织中四环素类抗生素的高灵敏度测定方法，匀质后的动物组织通过4.8%高氯酸溶液的提取，提取液用Oasis HLB固体小柱进行萃取净化，进行液相色谱测定。检出限为20～100 μg/kg，相对标准偏差为5.1%～7.1%，平均回收率为80%～82%。

薛婷婷等人[11]开发了鱼类中万古霉素和去甲万古霉素残留量的检测方法。样品经0.1%甲酸水-乙腈混合溶液提取，用正己烷去脂，固相萃取柱C18和PCX净化后，高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行检测。方法检出限为2.0 μg/kg，定量限为5.0 μg/kg，平均回收率为92.8%～96.5%，相对标准偏差为4.5%～7.0%。

固相萃取法需要的有机溶剂量少、分离效果好、回收率高、操作简单，但其样品净化量少，富集倍数有限，部分固相萃取净化效果不理想，有的样品需要同时利用几种不同类型的固相萃取柱进行萃取净化才能获得理想的结果。

1.5 固相微萃取（SPME）

随着科技的发展，人们在固相萃取技术的基础上逐渐发展起了固相微萃取技术。固相微萃取是根据有机物与溶剂之间“相似相溶”的原理，利用涂有熔融石英纤维的固定相对待测组分的吸附作用，将组分从试样基质中进行萃取并富集的前处理方法。

Dong Zong Mu等人[12]开发了一种建立直接浸入式固相微萃取-高效液相色谱法对废水中6种四环素残留检测的方法，检出限达到0.36～0.71 μg/L，该方法已成功用于蛋禽养殖废水中四环素类残留量的检测。

固相微萃取集萃取、富集和进样于一体，操作简单，前处理过程中不用有机溶剂，减少了对环境的污染。但是，固相微萃取相对于传统的SPE萃取方式，回收率相对较低，对于复杂基质的样品萃取效果不佳，且无法分离提取处于结合态的待测物。

1.6 基质固相分散（MSPD）

基质固相分散[13]是将样品与固相萃取填料一起混合研磨，得到半固态的混合物，并将其作为填料装柱，然后选择合适的淋洗剂洗脱出各种待测物。该技术结合了传统样品前处理中的匀浆、组织细胞裂解、提取、净化等多个过程，简化了操作步骤，节省了时间，避免了样品的损失。

王学翠等人[14]建立的以多壁碳纳米管为分散材料的基质固相萃取技术，检测了牛奶中6种四环素类抗生素。实验取多壁碳纳米管及作为辅助研磨的EDTA和草酸，与样品混合研磨均匀装柱，经含0.01 mol/L甲酸的甲醇洗脱后，HPLC-UV测定，6种四环素的检出限为0.01～0.03μg/mL，回收率在78.7%～105.2%。

该方法样品用量少、提取净化效率高、耗时少、节省溶剂，但研磨的粒度大小和填料技术的差别会使结果有所差异，因此使此方法不易标准化。

1.7 QuEChERS法

QuEChERS法[15]是近年来发展起来的一种样品前处理技术。QuEChERS是快速（Quick）、简单（Easy）、便宜（Cheap）、有效（Effective）、耐用（Rugged）和安全（Safe）的缩写，是集以上优势于一体的样品前处理技术。该方法是匀质后的样品经溶剂提取后，加入固体干燥剂和杂质吸附剂，与基质中的干扰物质结合，然后再通过离心方式去除，以达到净化的目的。

薛荣旋等人[16]建立一种QuEChERS技术结合超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）测定鱼肉中抗生素残留的检测方法。样品首先经过1%甲酸乙腈提取，提取液用QuEChERS体系净化后，直接进行UPLC-MS/MS测定，结果诺氧沙星、洛美沙星、环丙沙星、氧氟沙星、恩诺沙星和培氟沙星6种抗生素的检出限为1.0～2.5 μg/kg，回收率为86.6%～120%，相对标准偏差为0.59%～7.6%。

卜明楠等人[17]建立了QuEChERS结合液相色谱串联质谱测定虾肉中72种兽药残留的检测方法。样品经5%醋酸乙腈、无水硫酸钠和氯化钠匀质提取后，提取液经C18为分散剂的QuEChERS技术充分提取后，提取液经浓缩后，进行测定。定量下限范围为0.02～33.58 μg/kg。除了熊脱氧胆酸、头孢喹咪、头孢吡啉、林可霉素、头孢噻呋、二嗪农的回收率在38%～58%，其他兽药残留物的回收率在61%～119%，相对标准偏差为1.6%～20%。

该方法对实验装置要求低，操作简便，溶剂使用量小，污染少，回收率高。但该方法对于高蛋白和基质较为复杂的样品的应用有一定局限性，还需要开发新型的萃取剂和净化剂。

2 结论和展望

样品的前处理是动物源性食品分析过程中最薄弱的环节，也是分析过程中的关键环节。样品前处理的步骤越少越好，因为每增加一步处理过程都会导致目标物的损失。目前样品前处理的仪器设备比较多，有些价格较贵，造成检测成本增加。动物源性食品分析前处理方法众多，可根据样品基质和抗生素残留的特点，选取合适的前处理方法。目前，前处理技术已经成为动物源性食品中抗生素残留分析的核心研究课题，研究选择性高、有机试剂消耗量少、样品用量少、成本低、高通量、简便、高效和环保的前处理方法是今后的发展趋势。

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