桑树MaPP2C8基因克隆及其干旱胁迫下的表达

黄仁维，祁伟亮，曾 睿，任迎虹

(成都师范学院 化学与生命科学学院，特色园艺生物资源开发与利用四川省高校重点实验室，成都 611130)

桑树(MorusalbaL.)属桑科(Moraceae)桑属(MorusLinn.)植物，由于其良好的适应性而广泛分布于世界各地，在中国已有5000多年的种植历史[1]。桑树的果实桑葚味道鲜美，营养丰富，深受消费者的喜爱[2]。桑叶作为家蚕(Bombyx)唯一的营养来源具有重要的生态学意义，对养蚕业具有极其重要的作用[3]。桑树具有一定程度的耐旱性，适应性较强，被誉为生态经济两用型树种[4]。但由于地理位置的不同，尤其在中国的北方地区，年降雨量少，严重的干旱极大地影响桑树的种植，且不同品种桑树的耐旱性差异大，同样严重制约了不同桑树品种的推广[5-6]。植物抗性基因产生响应是植物应对外界各种胁迫的关键环节，因此克隆桑树抗性相关基因，解析其胁迫响应和抗性机制有利于桑树的抗性育种。

植物对外界胁迫的响应受多种基因的调控。植物蛋白磷酸酶(protein phosphatases, PPs)在植物中参与多种信号传导途径，在可逆的磷酸化反应中用于抵消激酶的作用，其中，2C型PPs(PP2Cs)是植物PPs的主要类群[7]。近年来研究发现，PP2Cs参与多种与脱落酸(ABA)相关的信号传导通路，使得PP2Cs被认为处于植物逆境响应和发育主要信号通路的中心位置[8]。截止目前，研究人员已在多个物种中鉴定出PP2C家族成员，对PP2C基因家族成员的分子、生化、遗传及功能研究均表明，PP2Cs参与调控植物生理的多个方面[9-11]。在对多种模式植物，如，拟南芥、玉米、水稻等的PP2Cs表达水平分析发现，PP2Cs基因受ABA及多种非生物胁迫的诱导，如干旱胁迫、渗透性胁迫、盐胁迫及低温胁迫等[11-13]。He等[14]发现，玉米多个PP2C基因家族成员的表达受多种胁迫及ABA的诱导，表明这些基因可能在玉米抵御胁迫过程中扮演着重要的角色。综上可知，PP2Cs基因家族在植物响应外界胁迫中具有重要调控作用，克隆并解析桑树MaPP2C家族基因的功能对桑树抗性育种具有重要的作用。

目前针对PP2Cs家族基因的相关研究主要集中在一些模式植物上，对木本植物PP2Cs基因家族相关基因的研究还严重不足，有关桑树MaPP2Cs家族相关基因的研究还鲜有报道。本团队对前期的桑树转录组数据进行分析，发现MaPP2C8基因的表达受干旱胁迫强烈诱导。因此，本研究对桑树MaPP2C8基因及其启动子进行了克隆并分析，并对干旱胁迫处理下MaPP2C8基因的表达水平进行分析，为进一步研究MaPP2C8基因在干旱胁迫响应中的功能奠定基础，以期为桑树抗旱基因工程和遗传改良提供基因资源。

1 材料和方法

1.1 供试材料及处理

供试材料为桑树品种‘德果1号’，由四川省德昌县桑树种质资源圃提供，该品种为德昌县桑树种植主推品种，其果实品质好，果叶兼用具有极高的经济价值。

干旱胁迫处理：将桑树种子播种于含营养土的10 L种植盆中，每盆种植4株，于25 ℃、相对湿度20%～30%温室自然光下培养。待桑苗长至株高约45 cm左右时，挑选长势一致的幼苗进行干旱处理。依据土壤含水量的差异共设置4个处理组，分别为：轻度干旱胁迫(相对含水量为65%～75%)、中度干旱胁迫(相对含水量为50%～65%)、重度干旱胁迫(相对含水量为35%～40%)及重度干旱胁迫后复水组，每个处理组设置3个生物重复，每个重复3盆桑苗。具体操作为：将盆栽苗浇透水后进行自然干旱，每天傍晚取距盆表土10～15 cm处的土样，采用烘干称重法测定土壤含水量，土壤含水量达到胁迫处理要求后，于次日早晨8点取植株相同部位幼嫩叶片，用于干旱胁迫下的基因表达分析。复水组于重度干旱取材后立即给予充足水分，2 d后取样用于后续试验。

试验所用的高保真DNA聚合酶TopTaqDNA Polymerase、大肠杆菌感受态细胞购自北京全式金生物有限公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北京天根生物公司，反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A)、T载pMD19-T购自TaKaRa生物公司。RNA提取试剂盒RNAprep Pure Plant Kit(DP441)购自北京天根生物公司，引物合成和测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，SsoFastTMEvaGreen Supermix购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 基因克隆桑树叶片总RNA的提取按照RNAprep Pure Plant Kit说明书进行，cDNA第一链合成按照PrimeScriptTMRT reagent Kit说明书进行。根据桑树转录组数据库中的序列信息，设计引物(表1)，以桑树cDNA为模板，对MaPP2C8基因的cDNA序列进行扩增。PCR反应体系为：cDNA模板2 μL, 上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，10×TopTaq缓冲液2.5 μL，dNTPs 1.5 μL，TopTaq酶0.2 μL，最后使用ddH2O补足至终体积25 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，26个循环；72 ℃延伸10 min。利用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化PCR产物，将纯化后的产物连接至PMD19-T载体，转化大肠杆菌，经菌液PCR鉴定后送生工测序。

表1 实验所用引物及用途

1.2.2 启动子克隆桑树基因组DNA的提取采用改良CTAB法进行[15]。以NCBI数据库中报道的桑树基因组序列中MaPP2C8启动子序列为参考序列设计引物(表1)，以‘德果1号’基因组DNA为模板，进行PCR扩增。扩增体系及程序采用1.2中所介绍的体系及程序，扩增程序依据引物的退火温度和扩增片段的长度略作改动。

1.2.3 生物信息学分析利用OFR Finder在线分析工具分析MaPP2C8 cDNA序列的开放阅读框，利用BioEdit 7.2分析MaPP2C8 CDS序列所编码蛋白质的理化性质，采用Mega7.0构建MaPP2C8的系统进化树；使用WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)及SoftBerry ProtComp9.0(http://linux1.softberry.com/ berry.phtml)对MaPPCC-8进行亚细胞定位预测[16-17]；使用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/cgi-bin/ webface2. fcgi? jobid=600E2532000021E01EC0E49B& wait=20)对MaPP2C8蛋白的信号肽进行预测。采用在线分析软件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对MaPP2C8启动子顺势作用元件进行分析。

1.2.4 实时荧光定量PCR分析利用实时荧光定量PCR技术分析桑树MaPP2C8在干旱胁迫处理下的表达特性。以桑树MaPP2C8 cDNA序列为基础，设计1对MaPP2C8定量PCR引物，以桑树Maβ-actin为内参基因(表1)。qRT-PCR反应在伯乐BioRad CFX96Touch实时荧光定量PCR仪上进行，所有qRT-PCR反应均设置3个生物学重复，每个生物学重复设置3个技术重复。qRT-PCR反应总体系为10 μL：SsoFastTMEvaGreen®Supermix 5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，cDNA 0.5 μL，无RNA酶水H2O 3.5 μL。qRT-PCR反应程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火5 s，40个循环。利用Bio-Rad ManagerTMSoftware (Version 1.1)软件对试验数据进行分析，用2-ΔΔCT法计算MaPP2C8的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 MaPP2C8基因的克隆及序列分析

从‘德果1号’cDNA中克隆获得一段约1 300 bp的条带，对其进行回收、TA克隆、PCR鉴定及测序后发现，该条带全长为1 309 bp。将该序列与转录组测序获得的MaPP2C8参考序列进行比对后发现，该序列为MaPP2C8的cDNA序列。其编码的氨基酸与核苷酸序列对应关系如图1所示。MaPP2C8 CDS序列中A+T含量为44.25%，G+C含量为55.75%，共编码350个氨基酸，蛋白质相对分子质量为37.96 kD，等电点为5.099。其氨基酸残基中共含有48个带正电氨基酸，57个带负电氨基酸，116个疏水氨基酸，69个极性氨基酸。采用SignalP 4.1 Server对MaPP2C8蛋白信号肽进行预测后发现，该蛋白无信号肽序列，为非分泌蛋白。

图1 MaPP2C8核苷酸序列及其氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and amino acid sequences of MaPP2C8

2.2 MaPP2C8进化树分析

采用Mega7.0构建桑树MaPP2C8及NCBI中已报道的19个PP2C蛋白的系统进化树(图2)，结果表明，桑树MaPP2C8与大麻、番木瓜的亲缘关系较近，其中与同属于桑科的大麻亲缘关系最近，这进一步明确了MaPP2C8属于桑树PP2C基因家族成员。

图2 MaPP2C8与其他植物PP2C家族成员的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree analysis between MaPP2C8 and PP2C family members of other plants

2.3 MaPP2C8在PP2Cs基因家族中分支分析

在NCBI中进一步查询拟南芥中已报道的拟南芥AtPP2Cs家族成员，采用Mega7.0对MaPP2C8在PP2Cs基因家族中的归属分支进行分析，结果显示，MaPP2C8与其他拟南芥PP2C蛋白分为12个亚族(A-L)，MaPP2C8与A亚族成员聚为一类(图3)，这进一步为将来研究MaPP2C8基因的功能提供了参考。

图3 MaPP2C8蛋白与拟南芥(At)PP2C蛋白的进化树分析Fig.3 Phylogenetic tree of MaPP2C8 with PP2C proteins from Arabidopsis(At)

2.4 MaPP2C8亚细胞定位预测

采用SoftBerry ProtComp9.0(Plant)对MaPP2C8蛋白的亚细胞定位预测后发现，MaPP2C8蛋白可能存在于细胞中的多个位置，如细胞质、细胞核、细胞膜，表明MaPP2C8在细胞中的作用范围广泛，对各种胁迫的响应速度快。采用WoLFPSORT进一步对MaPP2C8蛋白的亚细胞定位进行分析后发现，MaPP2C8同样定位于细胞中的多个位置。结合相关文献[18-19]，推测MaPP2C8可能分布于细胞中的多个位置，如细胞质、细胞核及细胞膜等。

2.5 MaPP2C8启动子克隆及序列分析

依据NCBI中报道的桑树基因组序列为参考序列设计MaPP2C8启动子克隆引物，以‘德果1号’基因组DNA为模板，克隆获得MaPP2C8起始密码子上游一段大小为1 612 bp的序列，采用Plant-CARE在线软件对MaPP2C8启动子序列中的顺式作用元件进行预测发现，MaPP2C8启动子序列中含有激素响应元件、光响应元件及防御与胁迫响应元件(表2)。激素响应元件包括脱落酸响应元件ABRE、茉莉酸响应元件(CGTCA-motif和TGA-CG-motif)及水杨酸响应元件(TCA-element)；光响应元件包括Box 4、G-Box、Gap-box、MRE、Sp1、TCCC-motif；防御与胁迫响应元件包括TC-rich repeats。以上结果表明MaPP2C8 基因的表达可能受到这些因素诱导。

不同小写字母表示0.05水平上存在差异显著图4 MaPP2C8在干旱胁迫处理下的表达分析Different lowercase letters mean significant differences at 0.05 levelFig.4 The expression analysis of MaPP2C8 gene under drought stress

表2 MaPP2C8启动子顺式作用元件

2.6 MaPP2C8对干旱胁迫的响应

采用qRT-PCR技术检测桑树MaPP2C8在干旱胁迫下的表达特性。结果(图4)显示，MaPP2C8基因的表达受干旱胁迫强诱导，重度干旱时，MaPP2C8表达量达到最高水平。在重度干旱胁迫后，给予复水处理，并对MaPP2C8的表达水平进行分析，结果显示，MaPP2C8的表达量显著下降。以上结果表明，MaPP2C8可能参与了桑树对干旱胁迫的响应。

3 讨 论

桑树虽具有强的适应性，但在中国干旱给桑树产业所带来的损失仅次于病虫害[20]。干旱胁迫下，对不同抗性桑树品种的生理生化特性研究发现，抗性高的品种，其SOD、POD、CAT等酶的活性显著高于低抗性品种，而造成这一现象的根本原因是基因调控层面[21]。植物PP2Cs基因家族含有多个成员，参与植物生长发育过程的多个环节，如根系发育、叶片衰老、气孔发育、种子萌发、花粉萌发等，且在植物应答生物与非生物胁迫中发挥着重要作用[22]。Shazadee等[23]采用qRT-PCR技术对棉花30个GhPP2Cs基因进行分析后发现，这些基因在棉花响应高温、低温、干旱、盐等胁迫时起到重要的作用。在模式植物拟南芥中，已鉴定出80个PP2Cs成员，研究人员依据PP2Cs蛋白结构的不同，将其分为12个亚群(A-L)[11, 24]。Yu等[25]对小麦A亚族基因PP2C-a10进行研究，发现拟南芥中异源表达小麦PP2C-a10显著提高了转基因拟南芥种子的萌发率，降低了转基因拟南芥对干旱胁迫的抗性。He等[14]对玉米A亚族基因ZmPP2C-A2和ZmPP2C-A6在多种非生物胁迫下的表达模式进行分析，并在拟南芥中对其功能进行研究，结果显示，ZmPP2C-A2和ZmPP2C-A6在干旱、盐、ABA等胁迫条件下表达量显著增加，过表达ZmPP2C-A2和ZmPP2C-A6基因降低了拟南芥对干旱的抗性。以上均表明，PP2Cs基因家族成员在植物胁迫响应中具有重要调控作用。为此，本研究克隆了桑树MaPP2Cs家族成员MaPP2C8基因，以期为桑树的抗性育种提供基因资源。在对桑树MaPP2C8的分支归属进行分析发现，MaPP2C8归属于PP2Cs基因家族中的A亚族。此外，在对干旱胁迫下MaPP2C8基因的表达模式进行分析发现，MaPP2C8受干旱胁迫的强诱导，并且有趣的是，复水处理后MaPP2C8的表达量又显著降低，这些结果暗示着桑树MaPP2C8基因可能和其他A亚族基因一样参与了对干旱胁迫的响应。然而，这种响应机制还有待通过过表达MaPP2C8基因等实验来进一步研究。

植物激素ABA在提高植物对干旱等非生物胁迫的耐受水平方面发挥重要作用[26]。研究表明，多数PP2Cs基因在植物ABA信号通路中起重要调节作用，ABA与其受体(PYR、PYL、RCAR等)结合，抑制PP2Cs活性，使得SnRK2得到释放，释放的SnRK2激活ABF、AREB及ABI5等转录因子，从而调节ABA响应基因的表达水平，调节植物生长，响应外界胁迫[8, 27-28]。启动子在基因表达调控过程中起重要的作用[29]。为探讨MaPP2C8基因表达与ABA之间的调控关系，本研究对MaPP2C8基因的启动子进行了克隆，对启动子序列进行预测发现，MaPP2C8启动子中含有3个与ABA相关的元件ABRE，这暗示MaPP2C8的表达可能受ABA的诱导，因此，推测ABA可能通过诱导MaPP2C8的表达水平，进而对下游基因的表达进行调节，然而有关MaPP2C8的作用机制有待进一步研究。

综上所述，本研究克隆获得了桑树MaPP2C8基因及其启动子序列，并对其进行生物信息学分析和干旱胁迫应答分析，本研究结果为进一步研究MaPP2C8基因的功能及利用MaPP2C8基因进行桑树抗旱育种奠定了基础。