高迁移率族蛋白B1在婴幼儿视网膜母细胞瘤中的表达分析

柴勇，淦强，刘俊芳

（江西省儿童医院眼科，江西 南昌 330006）

视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，Rb）是婴幼儿时期最常见的眼内恶性神经母细胞瘤，可导致婴幼儿视网膜分离并侵犯视神经[1]。随着诊断和治疗方法的发展，发达国家Rb患儿的生存率得到极大的提高，而我国Rb患儿5年生存率仅为63%，治疗水平亟待提高[2-3]。视网膜母细胞瘤严重危害婴幼儿健康，而以手术、化疗为主的综合治疗不能确保根治率。因此，寻找早期诊断、化疗敏感性预示及预后判断生物指标对Rb的临床诊治具有重要意义。分子治疗为Rb的预防及治疗提供思路，其中高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）在多肿瘤细胞生长和凋亡等过程有重要作用[4-5]。本研究旨在探讨高迁移率族蛋白B1（HMGB1）表达水平与Rb组织分化程度及病理分期的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取本院2016年6月至2019年12月因视网膜母细胞瘤行眼球摘除术的Rb患儿眼球石蜡包埋组织52例，其中男28例，女24例；年龄3个月～8岁，平均年龄（4.8±0.6）岁；组织临床分期：分化型21例，未分化型31例；临床分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期6例，Ⅲ期9例，Ⅳ期18例，Ⅴ期15例。纳入标准：经眼眶CT、双眼彩色超声多普勒、儿童眼底照相机检查结果或眼球摘除术后病理检查确诊为Rb。排除标准：合并其他系统疾病；有不规范治疗史；病理组织不合格。另选取12例肿瘤旁正常视网膜组织作为对照组，其中男7例，女5例；年龄8个月～8岁，平均年龄（4.5±1.2岁）。两组年龄、性别等临床资料比较差异无统计学意义，具有可比性。本研究已经本院伦理学委员会审核批准。

1.2 方法 选取的病理组织经石蜡包埋烘干备用。包埋的组织切片经梯度乙醇脱蜡至水，用磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗；利用高温修复抗原后，每张组织切片滴加适量H2O2室温孵育后，滴加HMGB1一抗、二抗室温孵育；滴加适量二氨基联苯胺（DAB）液显色，苏木素复染后梯度脱水，中性树胶封片后观察。HMGB1单克隆抗体购自美国Sigma公司，DAB显色试剂盒购自上海拜沃生物科技有限公司，凝胶成像系统购自美国Beckman公司，荧光显微镜购自日本Nikon公司，DYY-6C型双稳定时电泳仪购自北京六一仪器厂。

1.3 免疫组化结果判断方法 HMGB1蛋白阳性表达为细胞膜和细胞浆同时染成黄色或棕褐色。每张切片随机选择5个高倍视野（×200倍），总计数细胞个数≥1 000个。HMGB1阳性细胞数为5%～25%为弱阳性（+），26%～50%为中阳性（++），＞50%为强阳性（+++）。PEBP4阳性细胞数5%～10%为弱阳性（+），11%～20%为中阳性（++），≥21%为强阳性（+++）。阳性率=弱阳性率+中阳性率+强阳性率。

1.4 观察指标 分析免疫组化染色阳性表达；分析不同分化的Rb组织标本HMGB1蛋白表达；分析不同分期Rb组织中HMGB1蛋白表达情况。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料以“±s”表示，比较采用t检验，计数资料以[n（%）]表示，比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化染色阳性表达 HMGB1主要位于细胞质近细胞核处，多呈棕黄或棕褐色。在Rb组织中阳性表达率为87.65%，高于正常视网膜组织中的62.38%，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 不同分化的Rb组织标本HMGB1蛋白表达 未分化型Rb组织标本中HMGB1阳性率显著高于分化型Rb组织标本（P＜0.05），见表1。

表1 不同分化程度Rb组织中HMGB1表达情况（±s，%）

表1 不同分化程度Rb组织中HMGB1表达情况（±s，%）

注：Rb，视网膜母细胞瘤；HMGB1，高迁移率族蛋白B1。与未分化组比较，a P＜0.05

分化类型 例数HMGB1阳性率未分化2186.72±6.73分化3161.28±5.16a

2.3 不同分期Rb组织中HMGB1蛋白表达情况 Ⅳ期Rb病理组织标本中HMGB1阳性率均显著高于Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ期的病理组织标本（P＜0.05）。Ⅴ期组织标本中HMGB1阳性率显著高于IV期（P＜0.05），见表2。

表2 不同病理分期的Rb组织中HMGB1表达情况（±s，%）

表2 不同病理分期的Rb组织中HMGB1表达情况（±s，%）

注：Rb，视网膜母细胞瘤；HMGB1，高迁移率族蛋白B1。与I+II+III期组比较，a P＜0.05；与IV期比较，b P＜0.05

病理分期 例数HMGB1阳性率Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ期1957.41±8.19Ⅳ期1879.64±7.28aⅤ期1587.72±8.37ab

3 讨论

Rb是婴幼儿时期最常见的眼内恶性神经母细胞瘤，严重威胁患儿的生存质量[6]。目前Rb的主要治疗手段为手术、化学减容疗法及温热疗法[7-9]，但约45%的患儿经保守治疗后肿瘤复发或产生新的肿瘤[10-11]。因此，寻找Rb防治新手段显得尤为重要，而分子治疗的日趋成熟为Rb治疗提供思路。深入研究Rb发生发展的相关分子机制，对Rb的早期诊断和临床个体化治疗有十分重要的意义。

HMGB1是真核生物细胞内典型的非组蛋白染色体结合蛋白，参与肿瘤的发生、生长、浸润及转移等过程[12-13]。当细胞内环境发生变化时，HMGB1会由坏死细胞及炎症细胞释放到细胞外，介导多种病理生理反应[13-15]。研究发现[16-17]，HMGB1在乳腺癌、肺癌等肿瘤组织中高表达。但关于HMGB1蛋白在视网膜母细胞瘤中的作用机制研究较少。推测HMGB1在视网膜母细胞瘤发展中有重要表达意义。本研究结果显示，HMGB1蛋白在正常视网膜组织及Rb组织中均有表达，主要位于细胞质近细胞核处，少量位于炎性细胞的胞浆中，与HMGB1在细胞中的生物合成特性具有一致性。HMGB1在Rb组织中阳性表达率均显著高于正常视网膜组织，提示Rb组织作为一类肿瘤，细胞增殖能力与凋亡水平会发生变化，而HMGB1在肿瘤的发生发展中有重要作用，其促肿瘤作用在Rb组织中的表达变化中得以体现。在不同分化程度和不同分期的Rb组织中，HMGB1在未分化性组织中的表达水平明显高于已分化型组织，且随着分期的增加其表达水平也提高。未分化肿瘤细胞有较强的增殖迁移能力，这种细胞活性的变化可能与HMGB1蛋白的表达增加相关。同时，随着Rb组织分期的增加，肿瘤的恶化程度及转移能力会不断提高，HMGB1在高分期组织中的高表达可能是参与了Rb组织的发展。

综上所述，本研究初步探讨HMGB1在Rb中的表达差异，可明确HMGB1蛋白在Rb的发展中有重要意义，关于HMGB1调控及作用机制有待于进一步深入研究。