竹叶提取物对哺乳仔猪回肠形态和抗氧化功能的影响

季书立,贠阳,贾沛璐,甘振丁,张昊,张莉莉,王恬

(南京农业大学动物科技学院,江苏 南京 210095)

氧化应激是内、外环境因素诱导机体氧化系统和抗氧化系统失衡的状态[1]。母猪在分娩时,仔猪从低氧的宫内环境进入高氧的宫外环境,引起血液氧分压骤变、细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)爆发式增多、氧化还原失衡,造成大脑、肝脏和肠道等代谢旺盛组织的氧化损伤,导致新生仔猪发病率和死亡率升高[2-3]。

肠道组织既是营养物质消化、吸收和代谢的主要器官,也是最大的免疫器官,对机体抵御病原体及有害物质的侵袭起着重要作用[4]。在新生阶段,仔猪肠道形态结构和生理功能尚不完善,对各种应激反应高度敏感,易导致肠道损伤和多种疾病的发生,严重影响仔猪的生长发育[5]。添加适宜的抗氧化活性物质是缓解仔猪肠道损伤、促进肠道发育的一种有效方法[6-8]。

近年的研究表明,黄酮类物质是一种高效的抗氧化剂,能够有效缓解由氧化应激引起的肠道损伤,改善肠道完整性,提高其抗氧化能力[9-10]。竹叶提取物(bamboo leaf extract,BLE)是一种源于竹叶、富含黄酮和多酚的天然活性物质,具有抗氧化和抑菌等多种生物学功效,被广泛应用于食品和化妆品行业[11-12]。研究表明,竹叶黄酮提取物可通过上调核转录因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)和血红素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)的表达缓解油酸诱导的HepG2细胞的氧化应激[13]。BLE还可以提高小鼠血清和肝脏的抗氧化酶活性,降低丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,减少氧化应激引起的急性胃黏膜损伤和肝损伤[14-15]。近年来,BLE更是以其丰富的原料来源、明确的功能因子、良好的食用安全性,在饲料添加剂领域崭露头角。Shen等[16]研究发现,日粮中添加BLE能有效提高肉鸡肌肉清除自由基的能力和抗氧化酶的活性。粟明月等[17]报道,奶牛日粮中添加BLE能显著降低血浆中的MDA含量。但BLE对哺乳仔猪肠道健康影响的研究尚未见报道。在前期研究中我们发现,灌喂适宜水平的BLE能在一定程度上促进哺乳仔猪的生长,但其潜在机制尚不明确。鉴于初生仔猪易受环境影响发生肠道氧化应激,阻碍仔猪健康发育,故本试验旨在研究BLE对哺乳仔猪回肠形态和抗氧化性能的影响,以期为BLE作为抗氧化剂在生猪养殖中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

BLE由浙江新篁生物科技有限公司提供,其有效成分包括总黄酮70 mg·g-1、总多酚50.42 mg·g-1。

1.2 试验动物与饲养管理

本试验在苏州安佑太仓种猪场进行。试验选取体重相近、胎次相同的3日龄雄性仔猪64头,随机分为4组,每组8个重复,每个重复2头仔猪。对照组(CON组)仔猪每天灌喂羧甲基纤维素钠溶液10 mL,试验组分别灌喂含100、200和300 mg·kg-1BLE的羧甲基纤维素钠溶液10 mL,试验期21 d。试验期间仔猪自由采食母乳和饮水,并按照猪场的正常免疫措施等进行饲养管理。

1.3 样品采集

试验结束时,从每个重复中随机选取一头仔猪,前腔静脉采集血液,4 ℃、3 000 r·min-1离心10 min,分离血清,保存于-80 ℃冰箱备用。腹腔注射戊巴比妥钠溶液,放血致死后剖开腹腔,分离回肠。从回肠中段取2 cm肠段纵向切开后,先用预冷的生理盐水冲洗内容物,再置于4%的多聚甲醛中固定,用于形态学观察。用无菌载玻片刮取回肠黏膜,保存于-80 ℃冰箱备用。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 肠道组织形态学观察将保存于4%多聚甲醛固定液中的回肠组织用不同梯度的乙醇溶液干燥处理。经二甲苯洗净,石蜡包埋,制备成5 μm的切片后,用苏木精和伊红染色,置于光学双目显微镜下观察。每张切片选取20个完整的绒毛和隐窝,使用Image-Pro Plus软件(Media Cybernetics,USA)测量其绒毛高度(villi height,VH)和隐窝深度(crypt depth,CD),计算其比值(VH/CD)。

1.4.2 氧化损伤以及抗氧化相关指标测定取适量回肠黏膜按照1∶4(m/v,质量体积比)的比例加入预冷的生理盐水,冰水浴中破碎、匀浆后,3 500 r·min-1离心10 min,取上清液保存于-20 ℃备用。回肠黏膜匀浆和血清中的总蛋白含量采用二喹啉甲酸(BCA)法测量。MDA、谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量和总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)以及总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性均采用试剂盒(南京建成生物科技有限公司)进行测量。

1.4.3 回肠黏膜RNA的提取和mRNA表达量的测定称取0.1 g回肠黏膜样品,加入1 mL Trizol后按照说明书提取回肠黏膜总RNA。经NanoDrop1000(Thermo Scientific,UK)进行纯度和浓度的检测后,再用15 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA,于-20 ℃保存。使用SYBRPremixExTaq试剂盒(TaKaRa,大连)进行实时荧光定量PCR(qPCR)反应。qPCR程序:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40个循环。目的基因的相对表达含量以β-actin为内参,采用2-ΔΔCT法计算。引物序列见表1。

表1 本试验实时荧光qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for real-time qPCR in this study

1.4.4 回肠黏膜蛋白的提取和蛋白表达量的测定将冷冻的回肠黏膜切成小块,用蛋白裂解液RIPA和苯甲磺酰氟研磨,提取冷冻肠黏膜中的蛋白质,并用BCA法测定蛋白浓度。将蛋白样品平衡至统一浓度后,加入等体积的上样缓冲液进行变性处理,样品-80 ℃保存。

用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对蛋白样品进行电泳,在300 mA条件下将蛋白湿转至聚偏二氟乙烯膜上。在室温条件下用50 g·L-1脱脂奶粉封闭膜2 h后,用含有0.1%吐温20的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(TBST)清洗干净,再依次经4 ℃一抗孵育过夜,室温二抗孵育,TBST清洗,显影液浸泡,最后用天能4600SF全自动化学发光图像分析系统(上海天能科技有限公司)扫描,扫描图像用Image-Pro Plus软件进行量化分析。

1.5 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 竹叶提取物对哺乳仔猪回肠黏膜形态的影响

由图1和表2可知:灌喂BLE改善了哺乳仔猪回肠绒毛形态。与CON组相比,灌喂BLE可提高仔猪回肠绒毛高度(VH),其剂量为300 mg·kg-1时效果显著(P<0.05),但对隐窝深度(CD)无显著影响(P>0.05)。另外,300 mg·kg-1BLE组仔猪VH/CD值相对于CON组显著提高(P<0.05)。说明BLE能促进仔猪回肠发育。

图1 竹叶提取物(BLE)对哺乳仔猪回肠绒毛形态的影响Fig.1 Effects of dietary supplementation with bamboo leaf extrat(BLE)on histologic morphology in the ileum of suckling piglets

表2 BLE对哺乳仔猪回肠肠道形态的影响Table 2 Effect of dietary BLE on histologic morphology in the ileum of suckling piglets

2.2 竹叶提取物对哺乳仔猪血清抗氧化指标的影响

由表3可知:与CON组相比,200和300 mg·kg-1BLE组仔猪血清中MDA含量均显著降低(P<0.05)。此外,200和300 mg·kg-1BLE组仔猪血清中T-AOC和GSH-Px活性较CON组均显著提高(P<0.05)。

表3 BLE对哺乳仔猪血清抗氧化功能的影响Table 3 Effects of dietary BLE on serum antioxidant function of suckling piglet

2.3 竹叶提取物对哺乳仔猪回肠黏膜抗氧化指标的影响

由表4可知:与CON组相比,灌喂BLE能显著降低哺乳仔猪回肠黏膜MDA含量(P<0.05)。300 mg·kg-1BLE组仔猪回肠黏膜SOD和GSH-Px活性相对于CON组显著提高(P<0.05),200 mg·kg-1BLE组仔猪回肠黏膜中GSH-Px活性相对于CON组显著提高(P<0.05),但对CAT和T-AOC活性影响不显著(P<0.05)。

表4 BLE对哺乳仔猪回肠黏膜抗氧化功能的影响Table 4 Effect of dietary BLE on antioxidant function in ileum mucosa of suckling piglets

2.4 竹叶提取物对哺乳仔猪回肠黏膜中基因mRNA表达水平的影响

由图2可以看出:与CON组相比,200和300 mg·kg-1BLE组仔猪回肠黏膜中Nrf2和GSH-PxmRNA表达水平均显著提高(P<0.05)。同时,与CON组相比,300 mg·kg-1BLE组仔猪回肠黏膜中SOD2和HO-1mRNA表达量也均显著提高(P<0.05),而灌喂BLE对哺乳仔猪回肠黏膜中CAT和GRmRNA表达没有显著影响(P>0.05)。

图2 BLE对哺乳仔猪回肠黏膜抗氧化基因mRNA表达量的影响Fig.2 Effects of dietary supplementation with BLE on antioxidant gene expression level in the ileum mucosa of suckling piglets

2.5 竹叶提取物对哺乳仔猪回肠黏膜抗氧化相关蛋白表达水平的影响

由图3可以看出:与CON组相比,200和300 mg·kg-1BLE组仔猪回肠黏膜Nrf2和SOD2蛋白表达水平均显著提高(P<0.05),表明BLE可以激活Nrf2蛋白并上调其下游SOD2蛋白的表达。

图3 BLE对哺乳仔猪回肠黏膜Nrf2和SOD2蛋白表达量的影响Fig.3 Effects of dietary supplementation with BLE on the protein expression levels of Nrf2 and SOD2 in the ileum mucosa of suckling piglets

3 讨论

小肠作为机体营养物质消化吸收代谢的主要器官,对动物体的生长发育起着重要作用。尤其在哺乳阶段仔猪尚不成熟的肠道形态结构和生理功能将迅速发育,其健康状况决定了仔猪的存活率及后期生长速率[18]。氧化应激会引起肠上皮细胞的凋亡,损伤肠道绒毛的完整性,影响肠道功能[19-20]。诸多研究表明,改善动物肠道氧化还原平衡对促进绒毛形态和组织发育具有积极意义[21-22]。本试验结果显示,灌喂BLE能提高哺乳仔猪回肠VH和VH/CD值。肠道绒毛的增长与上皮细胞的发育和成熟密切相关,在生长阶段,大量细胞由隐窝迁移至绒毛顶端,促使绒毛增长。这说明BLE可能通过提高仔猪回肠肠道抗氧化能力,促进仔猪肠道黏膜上皮细胞的发育,从而促进肠道绒毛的生长[23]。另一方面,小肠VH和VH/CD值越大,说明肠上皮表面积越大,肠道的消化吸收能力就会越强[24]。这意味着BLE具有促进回肠绒毛发育,提高仔猪消化能力的作用,这与前人的研究结果一致[25]。

对于需氧生物来说,一定浓度的氧化剂可以促进其生长、细胞分化、凋亡和免疫等各种生命活动[26]。但在新生阶段,动物机体发育不完善,抗氧化机能不健全,很容易受到外界环境影响导致应激反应的发生。由此产生的大量ROS堆积在体内得不到清除,导致机体氧化还原系统的平衡被打破,并造成氧化损伤[27]。

MDA作为脂质氧化的主要产物之一,其水平的高低常被用来衡量机体氧化损伤的程度[28]。本试验结果显示,灌喂200或300 mg·kg-1BLE均能有效降低仔猪血清和回肠黏膜中的MDA含量,这可能与黄酮类和多酚类植物提取物可以通过清除自由基和螯合过渡金属离子来降低脂质氧化的能力有关[29]。此外,灌喂300 mg·kg-1BLE能够显著提高仔猪血清中的T-AOC、SOD和GSH-Px活性以及回肠黏膜中的SOD和GSH-Px活性,从而提高机体的抗氧化水平。

还有研究表明,许多黄酮类、多酚类植物衍生物可以作为Nrf2通路的潜在诱导剂[30-31]。Nrf2是氧化还原稳态的关键调节因子,负责调节细胞防御机制对抗氧化应激。正常生理状态下,Nrf2被其负调控因子Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1锚定在细胞质中。当机体发生氧化应激时,Nrf2被激活并移位至细胞核中,与小Maf蛋白聚合形成二聚体后再与抗氧化反应元件结合,调控其下游Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的表达[32]。本试验结果显示,灌喂200和300 mg·kg-1的BLE均能显著上调哺乳仔猪回肠黏膜Nrf2mRNA和蛋白的表达,并促进其下游HO-1、GSH-Px和SOD2等抗氧化基因的表达。HO-1能够催化铁与血红素基团结合为胆绿素,降低血红素基团促氧能力。胆绿素的生成能够有效清除过氧化物和超氧化物自由基,降低氧化损伤的发生[33]。这表明BLE能够激活Nrf2并调节其相关抗氧化酶的表达,提高机体的抗氧化能力。Shen等[34]发现日粮中添加BLE可以上调肉鸡肝脏中SOD和GSH-PxmRNA的表达,提高肝脏抗氧化能力。本试验结果与上述研究结果相一致。

综上所述,灌喂BLE促进了哺乳仔猪肠道绒毛形态结构的发育,这可能是因为BLE通过激活Nrf2信号通路,提高哺乳仔猪回肠抗氧化能力,从而缓解出生应激带来的肠道损伤,有利于仔猪肠道及机体的健康发育。但有关BLE对仔猪回肠炎症水平的影响以及仔猪回肠抗炎能力和肠道发育之间是否存在相关性仍不明确,需进一步研究。