酱香型白酒发酵过程中微生物及其酒醅变化分析

崔守瑜，戴奕杰

（1.钓鱼台宾馆管理局，北京 100830；2.贵州省产品质量检验检测院，贵州贵阳 550016）

白酒是中国的传统行业，是世界六大蒸馏酒之一。在不断发展过程中，根据其制作工艺及风味的不同，可分为清香、浓香、酱香等基本香型。其中，酱香型白酒以其“酱香突出、优雅细腻、柔绵醇厚、回味悠长”的独特风味，受到广大消费者的青睐。酱香型白酒的发酵过程独特而复杂，包括大曲制作、堆积发酵及窖池轮次发酵等[1]，高温堆积、高温蒸馏、多轮次发酵、生产周期长、贮存时间长等特点使得酱香型白酒区别于其他香型酒[2]。酱香型白酒在生产过程中，多阶段多轮次的微生物发酵是质控的关键步骤，因此每个发酵阶段酒醅中的微生物动态变化，对后期白酒产量及风味均具有重大贡献。尤其堆积发酵是大曲制作和酒窖发酵之间的桥梁[3]，开放式的地面堆积发酵能使环境中的微生物参与到整个发酵过程，调整酒醅中微生物群落结构，以促进酒醅中的物质充分分解转化，还为美拉德反应提供了前提条件。

最近的研究主要集中在酒曲的质控提升、窖泥中微生物群落的特征及酒的风味成分[4-5]，也有研究根据不同香型酒，分别研究清香型、浓香型、酱香型酒发酵时间的不同，比较菌群多样性与风味的相关性[6-7]。杜艾明[8]调查了清香型白酒酿造核心功能微生物，主要是乳酸菌、醋酸杆菌、芽孢杆菌、酵母菌及少数霉菌，这些菌群的更新变化与酒中的风味成分具有直接关系。高江婧[9]研究了浓香型白酒酒醅中风味物质与微生物群结构随发酵时间的变化规律，发现窖池底泥为酒醅提供了梭菌科和瘤胃菌科等厌氧微生物，这些微生物促进发酵后期己酸、丁酸、乙酸的合成，对浓香型白酒的风味具有重大贡献。高温堆积发酵作为酱香型白酒的特征工艺，是大曲酿造和窖池发酵的紧密连接，在堆积发酵过程中物料和微生物发生的变化规律也是众多学者所一直关注的热点问题。

本研究以酱香型白酒为研究对象，研究了在下沙、糙沙轮次堆积发酵中，酒醅堆积温度及pH 值与微生物群动态变化的相关性，为揭示酱香型白酒生产微生物变化及风味形成机制提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

样品：下沙、糙沙及7 个轮次起窖、下窖过程中的酒醅；化学试剂及培养基均为国药分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的采集

选取从下沙阶段到7 轮次高温堆积样品，及酒醅下窖于窖池发酵的样品。根据等距采样法，分别在酒醅上、中、下层等距采集3 个位点的样本。样本采集后混合均匀，并分装于无菌袋封装标记，于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 微生物的分离及计数

根据国标GB 4789.2—2016 方法处理样品。取25 g 不同加工阶段的酒醅样品，于装有225 mL 无菌生理盐水（含6 粒玻璃珠）的锥形瓶中，置于摇床中振荡5 min，使样品液充分均匀。吸取1 mL样品液于9 mL 无菌生理盐水中，混合均匀后，重复这一步，进行梯度稀释，并吸取100 μL 2～3 个适宜稀释梯度的样品液于不同微生物培养基中，对霉菌、酵母菌、乳酸菌、芽孢菌及菌落总数进行计数。

1.2.3 pH值的测定

根据文献方法[10]，取5 g 酒醅，加入45 mL 蒸馏水，置于漩涡振荡器上混合均匀。静置5 min，取上清液测定pH值。

1.2.4 温度的测定

采用探针温度计对不同发酵时期的酒醅堆进行温度测量，待温度计数值稳定后记录数据。

2 结果与分析

2.1 下沙、糙沙轮次堆积发酵酒醅的微生物变化

通过倍比稀释平板培养计数法发现，酒醅在不同发酵阶段微生物菌群呈动态变化。由表1 可知，发酵初期（下沙堆积）菌群得以快速增殖，菌落总数高达9.7×108CFU/g，主要为酵母菌、乳酸菌，但芽孢杆菌和霉菌仍占一定比例。在糙沙起窖阶段，可能是新物料加入，使得原有的微生物菌落数相对减少，但随着堆积发酵，微生物又利用新的物料进行生长代谢，因此各菌群在堆积过程中均有增殖现象。

窖池发酵可以再次富集培养环境中的微生物，在一轮次至三轮次的窖池发酵中，主要功能优势菌是酵母菌属，数量可达到106～107CFU/g，其次是霉菌属，数量在105～107CFU/g。酵母菌是参与发酵产酒产香的重要微生物，但酵母菌在高温环境下无法生存。酵母菌的带入可能是因为开放式的生产环境使得环境中的酵母菌散落在酒醅表面并在堆积发酵中生长繁殖，之前也有研究证明，酵母菌在酒醅中的丰度是上层高于中、下层[11]。因此在一轮次起窖阶段，酵母菌菌落数远低于堆积发酵时期。但在下窖期，酵母菌有增殖趋势，结合温度检测结果，可能是第一次下窖，窖池温度较低，适合于酵母菌的大量繁殖。但随着酒醅在窖池中继续发酵，微生物繁殖释放出大量热量，酵母菌无法存活在高温环境中，酵母菌在整个酿造过程中活菌数呈现出波浪型的变化规律。

霉菌的主要功能是分泌糖化酶、液化酶及蛋白酶，有助于分解酿酒原料中的淀粉、蛋白质等大分子物质，有促进风味物质形成的作用[12]。由表1 可知，霉菌在堆积阶段是呈上升趋势的，最大值可达1.2×107CFU/g，但下窖池发酵后，可能是因为高温、水分含量少、缺氧导致霉菌最终下降至400 CFU/g。霉菌与酵母菌的变化规律类似，也是呈动态波动的。据报道，霉菌能产生丰富的酯化酶系，所产生的酶能将酸与醇缩合成酯，同时，多种霉菌共同发酵，释放出含硫香味物质的前体，转化为含硫的杂环香味物质，形成特有的酱香味[13]。王晓丹[14]从酱香型大曲中分离得到1 株散囊菌——阿姆斯特丹散囊菌，该菌能产生L-芳樟醇、2-庚酮等花果香味，这对酱香型白酒的风味具有一定贡献。

细菌是广泛存在于整个制作工艺中的，因此通过高温发酵后所生存下来的细菌主要是嗜热菌，以芽孢杆菌属、乳酸菌属为主。在下沙堆积阶段，酒醅中乳酸菌含量很高，高达108数量级，而在发酵中期，回落到104数量级，后期可能窖泥中的厌氧菌掺入酒醅中迅速增殖，而在氧气充分时，部分死亡，发酵末期有回升的现象。芽孢杆菌作为高温大曲中重要功能菌组成成分，在整个发酵期间较稳定，堆积初期最高可达5.2×106CFU/g，但在整个发酵期基本保持在104CFU/g的丰度，发酵末期又回升到106CFU/g，符合菌群动态变化规律。

2.2 下沙、糙沙轮次堆积发酵过程中酒醅的温度变化情况（图1）

图1 不同发酵时期，酒醅温度的变化

在堆积发酵过程中，复杂的微生物群会分解淀粉、蛋白质等释放出大量热量，探究堆积发酵过程的温度变化有助于间接了解微生物的代谢情况。下沙、糙沙堆积从起堆到堆积完成大概需要3 d，因此我们检测了堆积24 h、48 h、72 h酒醅温度变化情况。由图1 可看出，不管是下沙还是糙沙堆积阶段，酒醅温度均随发酵时间的延长而升高，且在24～48 h 温度上升很快，在72 h 时达到最高，温度达41～51.8 ℃。而酒醅在一轮次下窖后，前3 天的温度变化情况较缓慢，但仍呈上升趋势。二轮次下窖后的酒醅温度变化同样较缓慢，属于延迟期。在经过前期几轮反复的起窖发酵和下窖发酵后，从三轮次下窖开始，酒醅在酒窖中发酵温度上升很快，且温度高达60 ℃。各阶段的发酵温度均与发酵时间直接相关，随发酵时间的延长而温度上升。

综合以上现象分析，各发酵阶段酒醅变化随发酵时间呈现直线型变化，且整体发酵过程成“V”型曲线，这可能与不同时期其优势功能微生物菌属的生长代谢有关联，而在后期发酵更利于嗜热性微生物生长代谢释放出大量的热量。

2.3 下沙、糙沙轮次堆积发酵过程中酒醅的pH 值变化情况（图2）

图2 不同发酵时期，酒醅pH值的变化

由图2 所知，在发酵初期，酒醅的pH 值由4.4下降到3.7，这可能是酵母菌的迅速繁殖，产生了大量的CO2，使得酒醅pH 值迅速下降。然而在堆积发酵中，由于霉菌、酵母菌、乳酸菌及芽孢杆菌均在大量繁殖，代谢产物中和了氢离子的浓度，使得pH值又回调到了4.4 左右。而在下窖到窖池发酵阶段，酒醅pH 值变化较小，基本稳定在3.5 左右，说明pH 3.5 左右时对产酸菌的生长有抑制作用，也可能是由于酒醅中的氧气被消耗掉，进入厌氧发酵，使得酵母从有氧代谢转化为无氧代谢，产生大量酒精。环境中的厌氧菌和酒醅中的兼性厌氧菌得以增殖，代谢产生有机酸，大部分有机酸为弱酸，对pH值影响不显著。

3 小结

通过酱香型白酒酒醅的不同生产加工阶段，研究了酒醅中主要的优势微生物菌群及温度、pH 值的变化，发现在整个发酵生产过程中，菌落总数呈现出一个动态的“V”型变化规律。前期主要以酵母菌属、乳酸菌属发酵产热产酸，中期芽孢杆菌生长较稳定，由于窖池厌氧发酵，酒醅堆积溶氧量不够，升温较缓慢。后期因酿造原料被充分分解，形成了较大的细孔，且pH 值下降到了3.5 抑制了霉菌及酵母菌的生长，但厌氧性芽孢杆菌得到大量繁殖，释放出大量热量。每个发酵阶段的优势功能菌根据发酵环境及条件的变化进行更替，以充分利用酿造原料中的营养物质进行代谢分解，释放出各种生物酶，代谢产生具有香味或风味的代谢产物，为提升酒产量及酒质做出了一定贡献。