苗药铁筷子对免疫抑制小鼠免疫功能的影响*

丁晓丽，索 萍，钱海兵

(1.贵州中医药大学，贵阳 550025；2.贵州省中医药方证药理研究特色重点实验室，贵阳 550025)

免疫通常是指非己抗原性物质进入体内，机体能清除异物，保持身体功能平衡的一种生理功能。当免疫过强时会引发超敏反应、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病，但当免疫功能过低时又会诱发其他免疫缺陷综合征[1]，因此寻找有效稳定的免疫调节剂十分重要。苗药铁筷子(Helleborus thibetnus Franch.)为蜡梅科蜡梅属(Chimonanthus)植物蜡梅(Chimonanthus Praecox L.Link)及山蜡梅(Chimonanthus nitens Oliv.)的干燥根及根茎[2]。课题组前期有将其用于类风湿性关节炎的研究，但并未进行针对免疫影响的探索。因此本文采用环磷酰胺建立免疫力低下小鼠模型，探究铁筷子对免疫功能低下状态的影响，为苗药铁筷子用于免疫性疾病提供药理学基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物

SPF级昆明种小鼠，雌雄各半，体重18～22 g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，实验动物使用许可证：SCXK(辽)2015-0001。

1.1.2主要仪器

紫外可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司)；低温高速离心机(XK-400，江苏新康医疗器械有限公司)；电子分析天平(ALC-210.3，北京爱科勒有限公司)；酶标仪(Infinite M200，北京新风机电技术公司)；8 mm小鼠耳朵打孔器；血细胞分析仪(XT-2000i，希森美康集团)。

1.1.3药品与试剂

黄芪颗粒(贵州汉方药业有限公司，批号20180312)；环磷酰胺(源业生物有限公司，批号X22D8Y51136)；印度墨汁(源业生物有限公司，批号L08A9G67537)；干扰素(IFN)-γ酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(欣博盛生物有限公司，批号M181128-101a)；白细胞介素(IL)-6 ELISA试剂盒(欣博盛生物有限公司，批号M181128-004a)；IL-2 ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，批号ml083138)；肿瘤坏死因子(TNF)-α ELISA试剂盒(欣博盛生物有限公司，批号M181128-102a)；IgM ELISA试剂盒(欣博盛生物有限公司，批号M181128-129a)；补体C3 ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，批号DP7VCQ53L1)；补体C4 ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，批号ml002048)。

1.1.4苗药铁筷子水煎液制备

苗药铁筷子，采自贵阳市乌当区三江镇农场，经贵州中医药大学药学院生药教研室刘晓龙博士鉴定为蜡梅科蜡梅属植物蜡梅的根。铁筷子水煎液的制备：取铁筷子药材100 g，加水，浸泡0.5 h，然后用电磁炉加热、过滤，连续2次，合并2次滤液，浓缩至100 mL，最后得到铁筷子水煎液，其浓度为1 g/mL，使用前用水稀释成相应倍数。

1.2 方法

1.2.1动物分组及处理

SPF级昆明种小鼠，180只，雌雄各半，适应性喂养7 d后分成空白组，模型组，铁筷子水煎液高、中、低剂量组(1.00、0.50、0.25 g/mL)，阳性组(黄芪颗粒0.50 g/mL)。于实验第1天，除空白组外，其余各组小鼠均用环磷酰胺(50 mg/kg)隔日腹腔注射给药，连续30 d，共注射15次，建立免疫低下小鼠模型。空白组腹腔注射等体积生理盐水。给药组分别按铁筷子水煎液高、中、低剂量灌胃给药，阳性组给以黄芪颗粒水溶液，空白组和模型组灌胃等体积生理盐水，每天灌胃1次，连续30 d。每天灌胃时间晚于环磷酰胺注射时间30 min。

1.2.2小鼠体重增长率、免疫器官指数的测定

末次给药24 h后，各组小鼠抽取10只，记录小鼠体重，摘眼球取血，颈椎脱臼处死，取胸腺，用滤纸吸干脏器并称重，计算脏器指数。计算公式:体重增长率%=(最终体重-初始体重)/初始体重×100%。胸腺指数=胸腺重量(mg)/体重(g)。

1.2.3迟发型超敏反应的测定

于给药后第20天，各组中选取10只小鼠腹部去毛，范围为3 cm2。均匀涂抹配制好的1%的二硝基氟苯，连续致敏5 d，实验最后1 d前将1%的二硝基氟苯10 μL均匀涂抹在小鼠右耳两面进行攻击，左耳涂抹丙酮。24 h后，摘眼球取血0.6～1.0 mL于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，处死小鼠后，用8 mm的小鼠耳打孔器，打下耳片，于万分之一的天平上精密称量其重量。左右耳重量之差即为肿胀度。肿胀度=右耳重量-左耳重量。

1.2.4碳廓清实验

1.2.5小鼠血清中IFN-γ，IL-2，IL-6，TNF-α，IgM，补体C3、C4水平及全血中红细胞与白细胞数的测定

将1.2.2所取的小鼠血进行离心，3 000 r/min离心10 min分离血清，装入EP管，-80℃保存备用，参照ELISA试剂盒说明书，检测血清中IFN-γ，IL-2，IL-6，TNF-α，IgM，补体C3、C4的水平。将1.2.3取得的小鼠全血在4 h内,利用血细胞分析仪对小鼠全血中的红细胞和白细胞的数量进行检测。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 对免疫抑制小鼠体重增长率和免疫器官指数的影响

模型组小鼠体重增长率、胸腺指数显著下降(P<0.05)，免疫抑制小鼠造模成功。铁筷子水煎液低、中剂量组及阳性组可提高免疫抑制小鼠的体重增长率，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；铁筷子各给药组和阳性组提高了免疫抑制小鼠胸腺指数(P<0.05)，见图1。

1:空白组；2:模型组;3:低剂量组;4:中剂量组;5:高剂量组;6:阳性组；a：P<0.05，与空白组比较；b：P<0.05，与模型组比较。

2.2 对免疫抑制小鼠迟发型超敏反应的影响

模型组小鼠耳肿胀与空白组相比明显降低(P<0.05)，与模型组相比，铁筷子中剂量、阳性组可显著增加小鼠耳肿胀度，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

1:空白组；2:模型组;3:低剂量组;4:中剂量组;5:高剂量组;6:阳性组；a：P<0.05，与空白组比较；b：P<0.05，与模型组比较。

2.3 对免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

与空白组比较，模型组和各给药组小鼠吞噬指数降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，除阳性组外，各给药组小鼠吞噬指数虽有增长但不显著(P>0.05)，见图3。

1:空白组；2:模型组;3:低剂量组;4:中剂量组;5:高剂量组;6:阳性组；a：P<0.05，与空白组比较；b：P<0.05，与模型组比较。

2.4 对免疫抑制小鼠血清中IFN-γ，IL-2，IL-6，TNF-α，IgM，补体C3、C4及全血中红细胞(RBC)，白细胞(WBC)的影响

模型组小鼠体内IFN-γ，IL-2，IL-6，TNF-α，IgM，补体C3、C4水平及RBC和WBC计数均降低，与空白组比较具差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，铁筷子中、高剂量及阳性组IFN-γ水平升高，铁筷子高剂量及阳性组IL-6、IL-2、补体C4水平升高，铁筷子组及阳性组TNF-α水平升高，铁筷子中、高剂量及阳性组小鼠体内IgM、补体C3水平均升高，且铁筷子各剂量给药组都提高免疫抑制小鼠的RBC与WBC计数，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

1:空白组；2:模型组;3:低剂量组;4:中剂量组;5:高剂量组;6:阳性组；a：P<0.05，与空白组比较；b：P<0.05，与模型组比较。

3 讨 论

免疫器官、免疫细胞和免疫分子共同构成了人体免疫系统，免疫功能紊乱时常引起疾病的发生，其中免疫力低下对机体防御能力有很大的影响，因此增强免疫能力是预防疾病发生的关键[3]。胸腺是一重要的中枢免疫器官，T淋巴细胞的生长发育与胸腺密切相关，T淋巴细胞可直接杀伤靶细胞，释放淋巴因子加强免疫应答[4-5]，胸腺指数反映了机体免疫能力的强弱。本次造模药物选用环磷酰胺构建免疫抑制小鼠模型，环磷酰胺可引起免疫器官重量减轻，产生免疫抑制[6-7]。因此，本次实验采用小剂量多次注射环磷酰胺(50 mg/kg)的方法建立免疫力低下小鼠模型[8]，结果表明注射过环磷酰胺的小鼠体重增长率明显下降，胸腺指数显著降低，说明免疫抑制小鼠模型造模成功，灌胃给药后，铁筷子可提高免疫抑制小鼠的体重增长率、胸腺指数来改善免疫抑制小鼠的免疫能力，说明铁筷子具有机体免疫保护作用。

吞噬指数主要用于判断巨噬细胞吞噬能力的强弱[9]，碳廓清实验常用于巨噬细胞吞噬能力的检测。本研究表明苗药铁筷子对免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬能力有改善作用。迟发型超敏反应是Ⅳ型细胞介导的迟发型变态反应，当机体再次受到相同抗原刺激后，抗原提呈细胞会作用于效应T细胞，CD4+细胞可通过分泌趋化因子，产生免疫损伤作用，出现炎症反应、肿胀[10]。模型组小鼠其免疫受到抑制，耳肿胀不明显，但铁筷子可增强免疫抑制小鼠免疫能力，提高免疫应答。红细胞、白细胞水平同样也反映了机体免疫能力的强弱，红细胞可识别携带抗原、促进巨噬细胞的吞噬能力，白细胞参与了机体的防御反应[11]，铁筷子可提高免疫抑制小鼠RBC、WBC数量，表明苗药铁筷子可通过调节RBC、WBC的数量调节免疫能力。

血清中的细胞因子、免疫球蛋白以及补体含量的变化反映了机体免疫能力的强弱，Th细胞可辨识抗原提呈细胞，维持机体正常免疫功能，主要分为Th1和Th2两个亚型，Th1型包括IL-2、TNF-α、IFN-γ；Th2型包括IL-6、IL-9等[12]。IFN-γ具有抗病毒、抑制细胞增殖、调节免疫及抗肿瘤作用；TNF-α主要由活化的巨噬细胞、NK细胞及T淋巴细胞产生；IL-6由活化巨噬细胞产生，可促进淋巴细胞增殖[13]；IL-2由活化T淋巴细胞产生，在调节免疫应答中具有重要作用[14]。免疫球蛋白是B淋巴细胞在抗原刺激下转化为浆细胞，可以产生能与抗原发生特异性结合的抗体[15]。其中IgM是分子量最大的免疫球蛋白，具有强大的杀菌、激活补体、免疫调理和凝集作用；补体C3主要由巨噬细胞和肝脏合成，在补体经典激活途径和旁路激活途径中发挥着重要的作用。注射了环磷酰胺的小鼠IFN-γ，IL-2，IL-6，TNF-α，IgM，补体C3、C4水平显著降低，铁筷子可明显提高这些因子的含量，特别是高、中剂量组，提示铁筷子可通过调节细胞因子，IgM，补体C3、C4来调节机体免疫能力。

免疫系统是一个复杂的综合体，其调节可能受多种因素的影响，前期课题组在对类风湿性关节炎的研究中，铁筷子的免疫抑制作用并不是其治疗的主要途径。本次实验发现铁筷子具有增强免疫的能力，可通过提高胸腺指数、巨噬细胞吞噬能力以及调节体内细胞因子，IgM，补体C3、C4的水平，RBC、WBC数量来增强机体免疫能力，改善免疫抑制状态。