固相萃取-高效液相色谱质谱法测定有机肥中18种抗生素残留

冷远鹏 薛晓康 孙华

摘要：建立了一种以固相萃取作为快速净化技术的高效液相色谱质谱法测定有机肥中18种抗生素的残留量，检测目标物包括14种磺胺类物质及4种氟喹诺酮类物质。样品经3 mL固相萃取柱快速净化后直接经超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MSMS）外标法定量，流速0.4 mL/min，流动相为甲醇及0.1%甲酸水梯度洗脱，色谱柱为C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），进样体积2 μL，正离子扫描多反应监测（MRM）模式，分析时长9 min。结果表明，有机肥基质对测试无明显基质效应，目标化合物在10～250 μg/L 范围内线性关系良好（r均大于0.995），方法检出限为0.013～2.679 μg/kg，定量限为0.042～8.929 μg/kg，精密度良好，重复6次测试保留时间的RSD在5%以内，浓度的RSD在10%以内，空白加标回收率为89.2%～106.1%。猪粪、鸡粪、鸭粪3个实际样品高低2个水平加标回收率为70%～130%。说明该方法简便可行、准确度可靠、灵敏度高，可为有机肥中抗生素测定标准制订提供参考依据。

关键词：固相萃取;高效液相色谱质谱法;动物粪便有机肥;抗生素

中图分类号：X592  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）11-0146-07

收稿日期：2020-09-01

基金项目：上海市科委上海化学品公共安全工程技术研究中心项目（编号：18DZ2280700）。

作者简介：冷远鹏（1990—），男，贵州遵义人，硕士，中级工程师，从事化妆品、农药残留检测相关研究。E-mail：lirper@163.com。

通信作者：薛晓康，博士研究生，高级工程师，主要从事化妆品、农药残留检测相关研究。E-mail：xxk@ghs.cn。

抗生素是指由微生物或高等动植物所产生的一类次级代谢产物，其具有抗病原体或其他活性，能干扰其他生物的细胞发育功能[1]。抗生素按化学结构可分为酰胺类抗生素、喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素、大环内酯类抗生素等，与其他类相比，喹诺酮类及酰胺类抗生素由于可直接化学合成、生产简便且价格低廉，在兽药中作为抗菌剂和促进生长剂被广泛使用。然而，由于其性质稳定，仅少部分被动物完全代谢消耗，大部分则以原药或次级代谢产物形式随粪尿直接排出体外[2]。当动物排泄物用于发酵制作有机肥时，发酵堆肥环境有利于抗生素的稳定存在并可导致部分抗生素代谢产物反应转化为原药[3-7]。

抗生素污染目前备受关注，有机肥中抗生素到达土壤环境后将影响和改变农作区土壤菌落的原始结构和功能，对农田造成污染[8-10]，部分抗生素通过植物吸收进入食物链，最终对人产生毒害作用[11-16]，残留在土壤中的抗生素还会诱导耐药菌种出现，从而对生态环境产生二次污染[17-18]。

有机肥中抗生素残留种类繁多，但目前我国的检测指标仅为在2016年发布的GB/T 32951—2016《有机肥料中土霉素、四环素、金霉素与强力霉素的含量测定 高效液相色谱法》，还未建立有效检测有机肥中喹诺酮类及酰胺类抗生素的方法。在限值规定方面，我国原农业部公告第235号规定了《动物性食品中兽药最高残留限量》中动物源性食品中磺胺的最高残留限量为100 μg/kg，猪肌肉中喹诺酮限量为100 μg/kg。相对于肥料业，近年来食品业和环境业中抗生素残留有了一定的研究[19-22]，但有机肥中喹诺酮类及酰胺类抗生素的检测分析相关研究较少，目前也还没有相关国家标准。

研究采用固相萃取法提取有机肥料样品，联用高效液相色谱质谱，以实现有机肥料中18种常见抗生素（14种磺胺类及4种氟喹诺酮类）残留的同时、快速测定。已有3类有机肥样品测试证明方法具有较高的准确度和精密度，以期为相关标准的制订提供了参考，降低生态污染风险，保护生态和健康安全。

1 材料与方法

1.1 样品

市售有机肥，基底为猪粪、鸡粪或鸭粪单一动物粪种。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

ACQUITY TQD型高效液相色谱质谱联用仪[美国沃特世（Waters）公司];PL2002型电子天平（梅特勒托利多集团）;TDL-5离心机（上海安亭科学仪器厂）;Oasis PRiME HLB固相萃取柱（规格为6 mL，美国沃特世公司）;pH计FE20（梅特勒托利多集团）;0.2 μm滤膜（美国沃特世公司）;2 mm 試验筛（绍兴市上虞纱筛厂）;Vortex 3000涡旋振荡器[维根技术（北京）有限公司]。

1.2.2 试剂

所用化学试剂无特殊说明均为分析纯，试验用符合GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》的一级水标准。

（1）抗生素。磺胺吡啶、磺胺哒嗪、磺胺甲唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲异唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星，纯度不小于95%。

（2）其他试剂。甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、甲酸（色谱纯）、柠檬酸、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠、乙酸。

1.3 溶液配制

1.3.1 缓冲溶液

（1）McLlvaine缓冲溶液。将1 000 mL 0.1 mol/L柠檬酸溶液与625 mL 0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液混合，用氢氧化钠或盐酸调节pH值为4.0。（2）Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液。浓度0.02 mol/L，称取60.5 g乙二胺四乙酸二钠放入1 625 mL Mcllvaine缓冲溶液中，使其溶解，然后加入纯水5倍稀释，混匀。

1.3.2 标准溶液 分别称取18种适量的兽药标准物质，用甲醇溶解配制成100 μg/mL的标准储备液，于-20  ℃冰箱中保存。吸取适量标准储备液，用甲醇溶解配制成5 μg/mL的标准工作液，于-20 ℃ 冰箱中保存。吸取适量标准工作液，在试验前用含5%甲醇、95%的甲酸水溶液（甲酸浓度0.1%）的初始流动相溶液配制浓度为10.0、25.0、50.0、100.0、200.0、250.0 μg/L的标准溶液。

1.3.3 基质匹配标准溶液 吸取适量标准工作液，在试验前用不含该18种抗生素、经样品前处理的空白有机肥试样溶液配制成浓度为10.0、25.0、50.0、100.0、200.0、250.0 μg/L的基质匹配标准溶液。

1.4 样品前处理

准确称取2.0 g碾磨过筛后的有机肥样品于50 mL 离心管中，加入5 mL Na2EDTA-Mcllvaline缓冲液（pH值 4.0），涡旋混匀，再加入18 mL乙腈、2 mL乙酸，涡旋振荡20 min后4 000 r/min 离心10 min，获得含待测抗生素的上清液。取Oasis PRiME HLB固相萃取柱（吸附剂质量为60 mg，柱管体积为3 mL），将2 mL 上清液过固相萃取柱，保持约1滴/s的流速，准确量取1 mL流出液，过0.2 μm滤膜，获得经固相萃取净化的上机测试液。

1.5 色谱条件

色谱柱为C18柱，ACQUITY UPLC BEH（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）;柱温为35 ℃;流动相：A，甲醇;B，0.1%甲酸水溶液;流速为0.4 mL/min;进样体积为2 μL;梯度洗脱条件见表1。

1.6 质谱条件

离子源为电喷雾离子源（ESI）;扫描方式为正离子扫描;检测方式为多重反应监测（MRM）;脱溶剂温度为350 ℃;脱溶剂气流速为650 L/h;毛细管电压：2.0 kV;18种抗生素质谱参数见表2。

1.7 试验时间和地点

试验时间为2019年6月至2020年6月;试验地点为上海化工研究院有限公司（中国上海市云岭东路345号）1号楼302室。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

配制浓度为100 μg/L的18种抗生素单标，利用ACQUITY TQD型高效液相色谱质谱联用仪的质谱调节功能直接將标准溶液抽入质谱雾化进样。调节锥孔电压使母离子信号最大，再在此优化后的锥孔电压下开启碰撞，确定信号最强的子离子为定量离子并调节碰撞能量使子离子信号最大，确定信号次强的子离子为定性离子并调节碰撞能量使该子离子信号最大。优化后质谱条件如表2所示。

2.2 流动相的优化

以乙腈和甲醇溶液作为2种有机相进行18种抗生素混标溶液的进样对比试验。当乙腈作为流动相时，组分色谱峰较宽，分离度较低，且对于4种氟喹诺酮类抗生素出现峰拖尾现象，故确定有机流动相为甲醇。优化条件后标准溶液总离子流（TIC）色谱图及定量离子对色谱图如图1、图2所示，以甲醇为流动相，磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪及磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺-6-二甲氧嘧啶2组同分异构体均具有较好分离度，其具体情况如图2中9、10、11、13、14号所示。

2.3 基质效应

目前常用于评估基质效应（ME）的指标为基质匹配标准曲线斜率/标准曲线斜率（ME值）。若ME值大于1.2时，说明基质对浓度越高的样品具有越强的信号增强作用，即具有基质增强效应;若ME值低于0.8时，说明基质对浓度越高的样品具有越强的信号抑制作用，即具有基质抑制效应;若ME值介于0.8～1.2之间时，说明基质无明显基质效应[23]。如图3所示，18种抗生素的ME值均在0.8～1.0之间，说明有机肥基质对抗生素信号有轻微抑制作用。但由于ME值均大于0.8，基质匹配标准曲线需要找到确定不含有这些抗生素的有机肥，经过前处理过程后方能获得，不如用初始流动相直接配制的标准溶液使用方便，所以认为可忽略有机肥的基质效应。回收率试验将进一步确定有机肥基质及本方法其他因素的影响。

2.4 方法学评价

2.4.1 线性关系、检出限和定量限 取“1.3”节标准系列溶液，按“1.5”节色谱条件及“1.6”节质谱条件进样，以抗生素浓度（x）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程并确定相关系数（r），以3倍信噪比为检出限（LOD）、10倍信噪比为定量限（LOQ）。如表3所示，18种抗生素在10～250 μg/L 浓度范围内线性关系良好，相关系数r均大于0.995，方法检出限为0.013～2.679 μg/kg，方法定量限为0.042～8.929 μg/kg。

2.4.2 精密度 向空白有机肥样品中添加一定量标准储备液后进行前处理，使上机溶液中抗生素理论浓度为 50.0 μg/L，按“1.5”节色谱条件及“1.6”节质谱条件连续进样6次。如表4所示，抗生素保留时间的相对标准偏差（RSD）均在5%以内，浓度的RSD均在10%以内，空白加标回收率在89.2%～106.1%之间，说明方法精密度良好，前处理过程能够有效提取出抗生素，液相色谱质谱分析能够保持结果的稳定性及准确性。

2.4.3 实际样品测定及加标回收率 以基底为猪粪、鸡粪或鸭粪某单一动物粪种的市售有机肥，作为实际样品进行抗生素及加标回收率测定，低水平加标浓度为20.0 μg/L、高水平加标浓度为160.0 μg/L。如表5所示，猪粪样品中磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶有检出，其余抗生素未检出;鸡粪样品中氧氟沙星有检出，其余抗生素未检出;鸭粪样品中磺胺吡啶、磺胺二甲异唑、磺胺间二甲氧嘧啶有检出，其余抗生素未检出。3种粪种的样品加标回收率均在70.0%～130%之间，高低水平加标回收率无明显差异，说明该方法适用于实际有机肥样品中18种抗生素的测试。

3 结论

本研究建立了一种测定动物粪便基底有机肥中14种磺胺类抗生素、4种氟喹诺酮类抗生素残留的固相萃取-高效液相色谱质谱法。样品经提取净化前处理后上机测试，9min即可完成单针分析。

初始流动相标准曲线与基质匹配标准曲线对比结果显示，有机肥基底对测试无明显基底效应，减轻了标线配制难度。方法准确度和精密度良好、灵敏度高，适用于动物粪种制成的有机肥中常见抗生素痕量残留的分析检测。鉴于目前没有相关标准，本研究结果可为相关标准制订提供依据。

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