苏淮仔猪腹泻细菌性病原的分离鉴定与耐药性分析

王礼伟 周刚 柏传茂 杨生明 郭永久 唐炎 汪国莲

摘要：为了解淮安地区苏淮猪仔猪出现细菌性腹泻的病因并提供治疗方案，采集腹泻仔猪的肛拭子样品共95份，对采集的样品进行细菌分离与鉴定、动物致病性鉴定及耐药性分析。结果显示，本次试验共分离鉴定到78株大肠杆菌，92株沙门氏菌;动物致病性试验显示，大肠杆菌致小鼠死亡率为65.38%，沙门氏菌致小鼠死亡率为95.84%;药敏试验结果显示，大肠杆菌耐药率高于沙门氏菌，且均对青霉素类和林可霉素类高度耐药，对氟喹诺酮类耐药率最低。多重耐药结果显示，所有分离菌株均为多重耐药菌株，大肠杆菌主要表现8～10耐，沙门氏菌主要表现在6～8耐。

关键词：仔猪;腹泻;大肠杆菌;沙门氏菌;耐药性

中图分类号： S855.3  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）11-0127-05

收稿日期：2020-09-08

基金项目：苏北科技专项科技帮扶项目（编号：SZ-HA2019032）;淮安市农科院科研发展基金项目（编号：HNY202025）。

作者简介：王礼伟（1989—），男，江苏淮安人，硕士，助理研究员，主要从事动物传染病防控及农业科技服务。E-mail：wlw58@sian.cn。

通信作者：汪国莲，硕士，研究员，主要从事农业科技服务。E-mail：2567327519@qq.com。

仔猪腹泻伴有不同程度的腹泻、脱水、自身免疫力下降，是仔猪死亡和继发其他疾病的重要原因，影响养猪生产效率和盈利情况，给养猪业带来严重的经济损失，主要体现在发病率高、降低日增质量、延长出栏时间、饲料转化率下降、饲料成本增加等 [1-2]。仔猪腹泻是病原体、肠道环境和管理之间相互作用的结果，其中病原体的感染是导致仔猪发生腹泻的主要原因，根据病原体的不同，细菌引发的可分为埃希氏大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌等;病毒引发的如流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、非洲猪瘟病毒等;寄生虫引发的如刚地弓形虫、艾美耳球虫等 [3]。鉴于细菌性腹泻在规模化养猪场患病中的普遍性和重要性，为进一步了解淮安地区苏淮仔猪腹泻细菌性病原流行病学和抗生素耐药情况，本试验采集腹泻仔猪的肛拭子样本进行了细菌的分离鉴定、致病力试验及耐药性分析，旨在为疾病防控、减抗禁抗、食品安全提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 2020年1月至4月采集来自淮安地区3个苏淮猪养殖场出现腹泻症状的仔猪肛拭子95份。发病仔猪主要表现为精神不振、食欲不佳、被毛耸乱、拉黄白色稀软或水样粪便等。以灭菌棉拭子采集发病仔猪肛拭样品置于灭菌EP中，保存于-20 ℃冰箱待用。

1.1.2 试验材料 麦康凯琼脂培养基、SS琼脂培养基、MH琼脂培养基、MH液体培养基均购自青岛海博生物技术有限公司;无菌脱纤维兔血琼脂培养基的制备参考文献 [4];兽医临床常用药敏纸片均购自杭州微生物试剂有限公司，包括红霉素、阿奇霉素、克林霉素、林可霉素、链霉素、庆大霉素、多西环素、四环素、头孢唑啉、青霉素、利福平、氧氟沙星。

1.2 方法

1.2.1 細菌的富集、分离与纯化 将采集的肛拭子接种于5 mL MH液体培养基中，37 ℃恒温培养12 h。然后用接种环按照常规细菌分离方法分别接种（“Z”字形）于麦康凯琼脂培养基、SS琼脂培养基，37 ℃恒温培养18～24 h。挑取典型单个菌落接种于5 mL MH液体培养基中，37 ℃恒温培养12 h，划线接种到无菌脱纤维兔血琼脂培养基中，37 ℃恒温培养18～24 h，观察菌株溶血情况，同时接种到MH液体培养基中备用。

1.2.2 革兰氏染色镜检 将无菌脱纤维兔血琼脂培养基中单个菌落进行涂片、革兰氏染色、显微镜油镜下观察菌体的形状及染色特性。

1.2.3 细菌生化鉴定试验 将待检菌落按照伯杰氏生化鉴定手册进行生化鉴定。

1.2.4 动物致病性试验 将小鼠分成A、B、C 3组。A、B组小鼠分别依据体质量按0.02 mL/g腹腔注射经鉴定纯化的大肠埃希氏菌和沙门氏菌菌液，每种菌注射2只，C组小鼠分别依据体质量按0.02 mL/g 腹腔注射无菌生理盐水。接种后观察并剖检发病和死亡的小鼠，统计致病率。

1.2.5 药敏试验 吸取致死小鼠菌液100 μL置于MH琼脂培养基上，涂布涂匀，3～5 min后，待菌液干燥后，均匀贴上4片不同的药敏纸片（d=6 mm），参照文献 [4]的方法，放置恒温箱培养18～24 h后测量抑菌环的直径，根据抑菌圈的大小，根据《抗微生物药物敏感性试验执行标准》 [5]判定结果。

2 结果与分析

2.1 细菌分离鉴定结果

对腹泻仔猪肛拭子样本进行选择分离鉴定，由图1～图6可知，疑似大肠杆菌在麦康凯琼脂培养基上长出粉红色、光滑、湿润、边缘整齐、直径1.0～2.5 mm的菌落，其中12株在血琼脂培养基上生成透明溶血环;挑取典型单个菌落进行革兰氏染色、镜检，疑似大肠杆菌为两端钝圆、散在或成对、红色、革兰氏阴性短杆菌。疑似沙门氏菌在SS琼脂上长出乳白色、圆形、边缘整齐、光滑、表面有隆起、中间有针状黑点的小菌落，其中12株在血琼脂培养基上生成透明溶血环;挑取典型单个菌落进行革兰氏染色、镜检，疑似沙门氏菌为无荚膜、无芽孢、散在的革兰氏阴性直杆菌。

2.2 细菌生化鉴定结果

分离的疑似大肠杆菌最终有78株能够发酵乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇，吲哚反应阳性，MR反应阳性，V.P.反应阴性，柠檬酸盐反应阴性，三糖铁斜面底部产酸及产气、不生成硫化氢，符合大肠杆菌的生化特性;分离的疑似沙门氏菌最终有92株发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇，吲哚反应阴性，MR反应阳性，V.P.反应阴性，柠檬酸盐反应阳性，三糖铁斜面产碱、底部产酸及产气产硫化氢，符合沙门氏菌的生化特性。最终，分离鉴定得到78株大肠杆菌，分离率为82.10%（78/95）;分离到92株沙门氏菌，分离率为96.84%（92/95）。

2.3 细菌致病性试验结果

将分离鉴定的78株大肠杆菌菌液腹腔注射小鼠24 h后，小鼠被毛粗乱、喜卧少动、精神沉郁、厌食、排松软粪便等症状;48 h后开始死亡，剖检发现腹腔充满黏性黄色渗出物，肝脏、肾脏、脾脏肿大，肠道膨胀充气，划线培养后均能分离鉴定到大肠杆菌，大肠杆菌致小鼠死亡率为65.38%（51/78，溶血性菌株注射小鼠全部死亡）。将分离鉴定的92株沙门氏菌菌液腹腔注射小鼠24 h后，小鼠精神萎靡、战栗、被毛蓬松，少数出现便血、水样粪便等症状;48 h后开始死亡，剖检发现小鼠肠道充血、腹腔积水、肝脏和脾脏均有坏死点，划线培养后均能分离到沙门氏菌，沙门氏菌致小鼠死亡率为94.57%（87/92，溶血性菌株注射小鼠全部死亡）;对照组小鼠均正常。

2.4 细菌耐药性试验结果

对致死小鼠的51株大肠杆菌和87株沙门氏菌进行药敏试验，由表1可知，分离鉴定的51株大肠杆菌对林可霉素（100.00%）、青霉素（98.04%）、克林霉素（96.08%）、红霉素（94.12%）、阿奇霉素（90.20%）高度耐药，其余抗菌药物的耐药率分别为：利福平（84.31%）、链霉素（82.35%）、头孢唑啉（74.51%）等;分离鉴定的87株沙门氏菌对青霉素（94.25%）、林可霉素（90.80%）、克林霉素（87.36%）、多西环素（82.76%）高度耐药，其余抗菌药物的耐药率分别为：红霉素（59.77%）、阿奇霉素（55.17%）等。

2.5 细菌多重耐药结果

由图7可知，分离菌株多重耐药结果，51株大肠杆菌中分离株中8～10重耐药的占比最大，累计比例为72.55%（37/51），其中，最高为9重，耐药比例为29.41%（15/51），1～4重耐药菌株数为0%（0/51）。87株沙门氏菌分离株中6～8重耐药的占比最大，累计比例为68.96%（60/87），其中，最高为7重，耐药比例为28.74%（25/87），1～3重和11～12重耐药的菌株数为0%（0/87）。

3 讨论

根据国家统计局发布数据，受非洲猪瘟疫情的影响，2019年我国生猪存栏31 041万头，同比下跌27.5%;生猪出栏54 419万头，同比下跌21.6%，而仔猪作为育肥猪的种苗，提高仔猪存活率至关重要 [6]。腹泻是猪场常见传染病之一，然而腹泻的流行病学原因却十分复杂，自身生理因素、饲料营养缺乏、环境应激和饲养管理不当及其他病原体感染等因素，均可能会导致仔猪肠道生态内环境改变，使得变形菌门中的大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌等条件致病菌在内的多种菌群失调，最终导致仔猪细菌性腹泻等症状 [7-8]，Hermann-Bank等发现，肠杆菌属、肠球菌属增加了新生仔猪腹泻的风险且与肠道微生物变异密切相关，且使用疫苗接种或抗生素治疗效果有限 [9]。本试验对当地苏淮猪仔猪腹泻的细菌性病原进行分离培养鉴定，95份样本共分离出170 株病菌，大肠杆菌阳性率82.10%（78/95），沙门氏菌阳性率96.84%（92/95），混合感染率为73.68%（70/95）。黄美州等对甘肃地区新生仔猪腹泻细菌性病原调查后发现大肠杆菌与沙门氏菌混合感染最终导致仔猪严重腹泻 [10];李晨等从贵州地区7个养殖场128份仔猪肠道样本中分离到大肠杆菌的阳性率为60.94%（78/128），沙门氏菌的陽性率为16.41%（21/128） [11];李淑红等在湘西北地区猪场检测到沙门氏菌分离率为55.56%（10/18），大肠杆菌分离率为44.44%（8/18） [12];曲歌等在吉林地区21家规模化猪场117份仔猪腹泻粪便样本中进行PCR检测，分离出大肠杆菌104份，其中49份具有致病性，占样本总数的42.88%;分离出沙门氏菌19份，其中15份具有致病性，占样本总数的12.82% [13]，这进一步说明大肠杆菌在感染仔猪的普遍性，而沙门氏菌分离率差异性可能是由于地域差异、动物健康程度及养猪场用药情况不同所致。

另动物感染试验结果显示，大肠杆菌和沙门氏菌的致死率分别为65.38%（51/78）和94.56%（87/92），其中，溶血性菌株的致死率为100%，表明淮安地区分离菌株具有较强的毒力因子，与福建泉州地区大肠杆菌高致死率71.43%（30/42） [14]具有一致性。徐引弟等通过对致病性大肠杆菌开展药敏纸片试验并对24个耐药基因进行扩增分析，发现细菌耐药决定区基因发生变异是引起细菌耐药性的主要原因，进而从分子手段揭示了耐药细菌株的基因型和表型具有一定关联性，细菌产生多重耐药性的机制具有较高的复杂性 [15]。因此，对于苏淮猪可以参考从抗腹泻基因MUC13、FUT1进行定向选育，利用分子育种方案从源头上进行腹泻的防控 [16]。

近年来，养殖业已经大力开始提倡减抗禁抗行动，但在疾病的预防治疗、自配饲料的使用上，依然存在抗生素的滥用问题，致使细菌耐药性问题日趋严重 [17-18]。本研究对分离获得的致死小鼠大肠杆菌和沙门氏菌进行了12种抗菌药的耐药性分析，结果表明，大肠杆菌和沙门氏菌对林可霉素类和青霉素类高度耐药，耐药率均超过90%，除喹诺酮类外，其他抗菌药均呈现不同程度的耐药率。张青娴等对分离的1株猪源产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌同样对青霉素类、头孢类、四环素类、喹诺酮类抗生素耐药，而对氨基糖苷类抗生素敏感，并通过4种常见的ESBLs耐药基因扩增分析，提出加强产酶耐药菌的监测及保守地使用现有抗生素的观点 [19]。而李佳瑞等从25株耐药大肠杆菌携带的主动外排基因进行研究，acrA、acrB这2种主动外排基因和调控基因mar A和sox S的相对表达量和多重耐药的耐药谱数呈正相关，调控基因acrR的相对表达量和多重耐药的耐药谱数呈负相关 [20]。Xu等对我国北京等10个省份的动物、人的非典型致病性大肠杆菌（aEPEC）进行药敏纸片试验，结果显示，267株菌株中，128株（47.9%）检出多重耐药，40株耐药菌株对10种以上抗菌药物耐药，有47株（17.6%）菌株被鉴定为产超广谱β-内酰胺酶（ESBL），而从多重耐药情况看，致死小鼠大肠杆菌和沙门氏菌多重耐药情况严重，4耐及4耐以上菌株高达100% [21]，这一结果与Li等 [22]、田瑞 [23]研究基本一致，其中，Li等研究发现高达71.25%（57/80）的沙门氏菌菌株呈现多种药物耐药，对头孢菌素类及氨基糖苷类抗生素敏感 [22];田瑞等研究的大肠杆菌分离率为86.31%（580/672），累计产生23种多重耐药型 [23]。

4 结论

本研究从细菌性病原的角度对致苏淮仔猪腹泻的病因进行初步分析，发现大肠杆菌、沙门氏菌是主要致病菌，药敏纸片试验显示2种致病菌均呈现4重及以上多重耐药性，均对喹诺酮类药物高度敏感，试验结果可为苏淮猪细菌性腹泻症的病因和临床治疗提供参考依据。

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