宫颈鳞癌组织中HIF-1α、YAP、TAZ蛋白表达变化及意义

冯倩倩，阿孜尔古丽·阿布都克日木，努尔比亚木·买买提依明，陈晓琳，斯依提阿吉·麦麦提明，史娟，马红

1 新疆医科大学基础医学院病理教研室，乌鲁木齐830054；2 新疆医科大学基础医学院病原微生物教研室

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一。我国宫颈癌病死率整体呈上升趋势［1-2］。从宫颈上皮内瘤变（CIN）到宫颈癌的发生，是多步骤、多基因参与的长期复杂过程，侵袭和转移是导致宫颈癌预后差的主要原因。因此，探讨宫颈癌侵袭、转移的分子机制，寻找早期诊断和预后评估指标是宫颈癌研究中亟待解决的重大问题。缺氧诱导因子1α（HIF-1α）是维持细胞内氧代谢平衡的重要调控因子，其表达或活性增加与人类多种肿瘤的发生、发展密切相关［3］。研究发现，HIF-1α 激活 Hippo 信号通路，通过上皮－间质转化（EMT）、血管生成等促进肿瘤侵袭转移［4］。Yes 激酶相关蛋白（YAP）和PDZ 结合模序的转录共激活因子（TAZ）是Hippo 下游通路的两个关键转录共激活因子［5］。本课题组前期研究发 现 ，宫 颈 癌 siha、C33A 细 胞 中 HIF-1α、YAP、TAZ mRNA 表达增强，慢病毒干扰HIF-1α 表达后可抑制siha、C33A 细胞侵袭，并促进肿瘤细胞凋亡。本研究观察了 CSCC 组织中HIF-1α、YAP、TAZ 的表达变化及其相互关系，旨在探讨三者与宫颈癌发生发展的关系及可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 组织来源 收集医院病理科2016 年1 月—2019 年7 月存档的石蜡包埋组织。CSCC 组织40例，癌旁正常宫颈组织30 例。患者年龄31~83 岁，所有患者术前均无放疗、化疗及免疫治疗史，高分化19 例、中低分化21 例，有淋巴结转移15 例、无淋巴结转移 25 例。CIN 组织 58 例（CIN I 级 32 例、Ⅱ~Ⅲ级26例），患者年龄28~78岁。

1.2 HIF-1α、YAP、TAZ 检测 采用免疫组化 SP 法检测CSCC 组织、CIN 组织及癌旁正常宫颈组织中的HIF-1α、YAP、TAZ 蛋白。兔抗人HIF-1α、YAP、TAZ多克隆抗体购自英国Abcam 公司。SP 免疫组化试剂盒和DAB 显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。石蜡包埋组织进行连续3 μm厚切片，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化后微波炉抗原修复，滴加3%H2O220 μL阻断内源性过氧化物酶，然后滴加一抗4 ℃冰箱培育过夜。HIF-1α、YAP、TAZ 抗体的工作液浓度分别为1∶100、1∶150 和1∶200。次日滴加生物素标记的二抗，37 ℃孵育30 min。各步骤间隔均用 PBS 缓冲液（pH 7.4）冲洗 3 遍（10 min）。DAB 显色，苏木精对比染色，常规乙醇逆浓度梯度脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。每批染色均以上述抗体已知阳性的切片作阳性对照，以0.01 mol/L的PBS 代替一抗作阴性对照。HIF-1α 蛋白表达产物位于细胞核，YAP 和TAZ 蛋白表达产物位于细胞质或细胞核，细胞内有棕黄色颗粒者为阳性表达。随机每张切片取10 个高倍视野（200×）观察阳性细胞，计算阳性细胞百分比，阳性细胞百分比≥25%判定为蛋白表达阳性，细胞无染色或阳性细胞百分比<25%判定为阴性。

1.3 统计学方法 采用SPSS18.0 统计软件。计数资料比较采用χ2检验。相关性分析采用Pearson 相关分析法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CSCC 组织、CIN 组织及癌旁正常宫颈组织中 HIF-1α、YAP 和 TAZ 蛋白表达比较 CSCC、CIN 组织中 HIF-1α、YAP、TAZ 蛋白阳性表达率高于癌旁正常宫颈组织（P均<0.05）。中低分化的CSCC 组织中YAP 蛋白阳性表达率高于高分化组织；有淋巴结转移的CSCC 组织中TAZ 蛋白阳性表达率高于无淋巴结转移组织（P均<0.05）。详见图1、表1。

图1 CSCC组织、CIN组织及癌旁正常宫颈组织中HIF-1α、YAP和TAZ蛋白表达情况（免疫组化SP法）

表1 CSCC组织、CIN组织及癌旁正常宫颈组织中HIF-1α、YAP和TAZ蛋白表达比较［例（%）］

2.2 CSCC组织中HIF-1α、YAP、TAZ蛋白表达的相关性 40 例 CSCC 组织中，HIF-1α 与 YAP 蛋白均阳性表达 23 例、均阴性表达 8 例、HIF-1α 蛋白阳性且YAP 蛋白阴性 3 例、HIF-1α 蛋白阴性且 YAP 蛋白阳性6例，HIF-1α与YAP蛋白表达呈正相关（r=0.487，P<0.05）；HIF-1α 与 TAZ 蛋白均阳性表达 20 例、均阴性表达 7 例、HIF-1α 蛋白阳性且 TAZ 蛋白阴性 6例、HIF-1α 蛋白阴性且 TAZ 蛋白阳性 7 例，HIF-1α与TAZ 蛋白表达无相关性（r=0.274，P>0.05）；YAP及TAZ蛋白均阳性表达21例、均阴性表达5例、YAP蛋白阳性且TAZ 蛋白阴性8 例、YAP 蛋白阴性且TAZ 蛋白阳性 6 例，YAP 与 TAZ 蛋白表达无相关性（r=0.170，P>0.05）。

3 讨论

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，严重威胁女性生命健康［1］。宫颈癌在发展中国家的发病率和病死率远高于发达国家［2］。缺氧是大多数实体肿瘤的共同特征。HIF-1α 的表达和活性受氧浓度的精密调节，是细胞适应缺氧微环境的关键转录因子，其表达增加可增强肿瘤糖酵解、细胞增殖、肿瘤血管生成和EMT，在肿瘤的生长、侵袭和转移中发挥重要作用［6］。JAN 等［7］通过移植小鼠模型研究显示，在腺苷酸激酶4过表达激活HIF-1α，进一步诱导EMT，促进肺癌浸润和转移。COWMAN 等［8］在肾透明细胞癌中也发现，HIF-1α 在肿瘤细胞中高表达，与高肿瘤高分级和转移显著相关，与总生存率降低独立相关。本研究结果显示，与癌旁正常宫颈组织相比，HIF-1α 蛋 白在 CIN、CSCC 组织中表达升高，与YANG 等［9］研究结果一致。尽管 HIF-1α 蛋白在CINⅠ级和CIN Ⅱ~Ⅲ级的表达差异无显著性，但总体呈上升趋势，提示从CIN 向肿瘤转化过程中，异型细胞增生活跃，缺氧微环境刺激下HIF-1α 表达升高，参与 CSCC 的发生发展。YAN 等［10］亦发现宫颈癌组织中HIF-1α 表达越高，预后越差。本研究发现CSCC 组织中HIF-1α 表达与分化程度、淋巴结转移均无关，与相关研究结果一致［11］，但随着分化程度降低、淋巴结转移其表达呈上升趋势，提示HIF-1α 蛋白表达增强可能与预后不良有关。

Hippo 通路是近年来新发现的抑癌通路，通过激酶级联反应发挥负性调控作用。Hippo 通路失活参与了肿瘤的发生［12］。最近研究强调了Hippo 通路在控制肿瘤生长、保持细胞增殖与凋亡平衡及信号转导失调方面的作用，其核心效应因子YAP/TAZ的过度激活可导致细胞生长失控和恶性转化［13］。TOTARO 等［14］发 现 Hippo 信 号 通 路 的 失 活 可 使YAP/TAZ 过表达。HE 等［15］研究显示，YAP 在宫颈上皮细胞中的过度激活可诱导HPV 受体表达，破坏宿主细胞天然免疫，YAP 差异激活和表达决定了个体对HPV 的易感性。在乳腺癌细胞中，HIF-1α 和TAZ 相互作用，HIF-1α 增加 TAZ 的合成和核定位来刺激TAZ 表达和活性，抑制TAZ 表达会影响HIF-1α靶 基 因 的 低 氧 诱 导［16］。 CHOI 等［17］研 究 显 示 ，YAP/TAZ 的激活启动了胃癌的发病并导致下游MYC 表达上调，从而促进胃癌的侵袭和转移。本研究结果显示，YAP、TAZ 蛋白在 CIN、CSCC 组织中阳性表达率高于癌旁正常组织，并与CSCC 分化程度和淋巴结转移有关；进一步发现，YAP、TAZ 蛋白在CIN Ⅱ~Ⅲ级组织中的表达高于CIN Ⅰ级组织，提示CSCC的发生发展可能与YAP、TAZ过表达有关。

近年来研究表明，肿瘤细胞中YAP、TAZ表达受HIF-1α 的调节，通过EMT、血管生成等促进肿瘤侵袭转移［18］。LIN等［19］发现在乳腺癌细胞中HIF-1α可异常激活 YAP/TAZ，而 RASFF、MER 表达缺失，促进乳腺癌细胞增殖和转移。ZINATIZADEH 等［20］发现，低氧条件下 HIF-1α 对 YAP、TAZ 的调节方向和机制不同，在肿瘤细胞中HIF-1α 上调TAZ 表达，降低YAP 和磷酸化蛋白（S127）表达，通过激活ERK/MAPK 通路促进肿瘤细胞增殖。本研究结果也显示，CSCC 组织中HIF-1α与YAP蛋白表达呈正相关，因此推测HIF-1α可能通过激活YAP表达促进CSCC的发生发展。而HIF-1α 和TAZ 的关系还需增加样本量进一步论证。

综上所述，HIF-1α、YAP、TAZ蛋白在CIN、CSCC组织中阳性表达率高于癌旁正常宫颈组织，且YAP、TAZ表达与CSCC 分化程度、淋巴结转移相关，提示HIF-1α、YAP、TAZ 可能在 CIN 恶性转化、CSCC的侵袭转移中起着重要作用，有望成为CSCC 治疗的潜在靶点。本研究结果为进一步深入相关研究奠定了基础。