邻苯二甲酸酯降解真菌的筛选及其降解特性和土壤修复作用

于淑婷 万群 余向阳 陈小龙 方香玲

摘要： 从多年地膜污染棉田土壤中分离纯化出邻苯二甲酸酯（PAEs）降解真菌，筛选分离出对PAEs降解效果良好的3株非致病真菌PAE1、PAE6、PAE8，经形态学特征及 18S rDNA 序列分析，分别鉴定为菌核生枝顶孢霉（Acremonium sclerotigenum）、辐毛鬼伞（Coprinellus radians）、耐盐枝孢菌（Cladosporium halotolerans）。3株真菌在邻苯二甲酸二丁酯 （DBP）起始质量分数为10 mg/kg时降解效率最高，PAE6降解率达68.4%。3株真菌均能降解多种PAEs，推测出其降解生物代谢路径为：PAE→单酯→PA→PCA→CO2+H2O。将3株真菌接种到DBP及邻苯二甲酸二辛酯（DEHP）污染的土壤中，接菌后21 d，DBP及DEHP降解率分别为47.2%～70.6%、54.1%～73.4%，其中PAE6对DEHP的降解率最高，达73.4%。表明3株真菌对土壤中DBP及DEHP污染具有良好的修复作用。

关键词： 邻苯二甲酸酯（PAEs）;降解真菌;降解特性;土壤修复

中图分类号： X592 文献标识码： A 文章编号： 1000-4440（2021）03-0660-07

Isolation， degradation characterization of phthalate-degrading fungi and their application in phthalate-contaminated soil

YU Shu-ting 1， WAN Qun2， YU Xiang-yang2， CHEN Xiao-long2， FANG Xiang-ling1

（1.College of Pastoral Agriculture Science and Technology， Lanzhou University， Lanzhou 730020， China;2.Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract： Three non-pathogenic fungi PAE1， PAE6， PAE8 with good degradation effect on phthalate esters （PAEs） were isolated after the PAEs degradation fungi were separated and purified from the cotton field soil contaminated by plastic film for many years in Xinjiang. Fungi PAE1， PAE6 and PAE8 were identified as Acremonium sclerotigenum， Coprinellus radians and Cladosporium halotolerans respectively based on the morphological characteristics and 18S rDNA sequence analysis. Three fungi reached the maximum degradation efficiency when the initial mass fraction of dibutyl phthalate （DBP） was 10 mg/kg， and the degradation rate of PAEs was 68.4%. The three fungi could degrade a variety of PAEs， and it was speculated that their biodegradable metabolic pathway was PAE→monoester→PA→PCA→CO2+H2O. The three fungi were inoculated in the soil contaminated by DBP and dioctyl phthalate （DEHP）， the degradation rate of DBP and DEHP were 47.2%-70.6% and 54.1%-73.4% respectively 21 days after inoculation， and the degradation rate of PAE6 against DEHP was 73.4%， and was the highest. The results indicated that three fungi showed good repairing effect in the soil contaminated by DBP and DEHP.

Key words： phthalic acid esters （PAEs）;degrading fungi;degradation characteristics;soil repair

鄰苯二甲酸酯（Phthalic acid esters，PAEs）主要用于聚氯乙烯材料，起到增塑剂的作用，被普遍应用于化妆品、清洁产品、包装材料、医用材料及玩具等数百种产品中。由于其应用广泛及不科学的处理方式，PAEs在土壤、沉积物、水体、大气等环境中[1-3]甚至生物体[4]中均有不同程度的检出，成为各类环境中常见有机污染物之一。PAEs污染不仅对农田土壤质量和农业生产造成不利影响[5-7]，其在生物体内积累并干扰内分泌的毒性对人类健康也具有潜在风险[8-9]。微生物降解修复是最快速有效的修复手段，也是目前研究的热点。

近年来对PAEs降解菌的研究主要为细菌方向，大量高效降解菌株已经从各类环境中分离得到。韩永和等[10]发现，Sphingomonas、Comamonas、Pseudomonas、Arthobacter和 Rodococcus等属的细菌具备降解PAEs能力，李方方等[11]的报道表明对邻苯二甲酸二辛酯（Dioctyl phthalate， DEHP）有良好降解效果的细菌集中在戈登氏菌（Gordonia sp.）、红球菌（Rhodococcus sp.）、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、不动杆菌（Acinetobacter sp.）等属。而对真菌降解PAEs的研究相对较少[11]。PAEs降解真菌的最早研究报道于1991年，Sivamurthy等[12]发现齐整小核菌（Sclerotium rolfsii）将苯二甲酸二甲酯（DMT） 转化为对苯二甲酸单甲酯（MMT），最终水解转化为对苯二甲酸。Chai等[13]筛选出14株可以降解DEHP的真菌。另外，黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium） [14]、胶红酵母（R. miicilaginosa）[15]、棒束梗霉属（Isaria sp.）真菌 [16]与尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum） [16-17]等真菌对PAEs也有一定降解效果。

有研究结果表明，污染土壤中添加PAEs 降解菌可大幅提高土壤中 PAEs 的降解速率。郭杨[16]发现束梗霉属（Isaria sp.）真菌30 d内将灭菌土壤中300 mg/kg PAEs降解69.02%。韩蕊等[18]发现爪哇正青霉（Eupenicillum javanicun）[10] 30 d内可将灭菌土壤中300 mg/kg复合PAEs降解65.2%。Lv等[17]筛选出的尖孢镰刀菌PO-Yi （Fusarium oxysporum） 可以将种植辣椒和茄子的土壤中总量 60 mg/kg PAEs分别降解76.8% 和63.1%。本研究从多年地膜污染棉田土壤中分离纯化PAEs降解真菌，研究其降解特性，并将其应用到PAEs污染土壤中研究其对土壤中PAEs的去除效果，以期揭示该菌株对PAEs 降解的基本规律，为PAEs污染的生物修复技术提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试地膜污染土壤取自多年PAEs污染棉田，于密封袋中4 ℃条件下保存。PAEs购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。取PAEs试剂溶于乙腈，制成10 g/kg的标准液，于4 ℃保存待用。无机盐培养基（MSM）：KH2PO4 3.00 g/L，NH4NO3 2.00 g/L，MgSO4·7H2O 0.10 g/L，CaCl2 0.01 g/L，乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2Na2O8）0.01 g/L，pH 7.5。

1.2 试验仪器

主要仪器有上海知楚ZQZY-90F振荡培养箱、上海奥析科学A-1506紫外可见分光光度计、Eppendorf Centrifuge 5804R高速离心机、苏州净化设备SW-CJ-1D单人净化工作台、Talboys 多管式旋涡混合器、安捷伦6890N气相色譜仪。

1.3 降解邻苯二甲酸酯真菌的分离和鉴定

1.3.1 菌种分离纯化 称取地膜污染棉田土壤5 g，加入含有50 ml无菌水的锥形瓶中，28 ℃、180 r/min避光振荡20 min，静置 30 min 后取 5 ml上清液，分别加入含邻苯二甲酸二丁酯 （Dibutyl phthalate， DBP）、邻苯二甲酸二辛酯（Dioctyl phthalate， DEHP）的45 ml无机盐培养基中进行 3 次梯度驯化。每次取5 ml菌液加入45 ml培养基中，28 ℃、150 r/min避光培养7 d，DBP、DEHP质量分数梯度均为5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg。取扩增培养后的菌液稀释1×102、1×103、1×104倍，然后取100 μl菌液分别在含10 mg/kg DBP、DEHP的MSM固体培养基平板上涂布，28 ℃下培养7 d，将不同形态的菌落进一步于MSM固体培养基上进行划线培养得到单菌落，于试管斜面培养基4 ℃保存。

1.3.2 菌种筛选鉴定 用打孔器打取菌饼，分别接种到含有 100 ml PDB培养基的锥形瓶中，150 r/min、28 ℃避光培养 72 h 诱导菌丝体生长。紫外分光光度计测定菌液660 nm下OD 值，用无菌水适当稀释控制菌液中含菌量一致。将5 ml 菌液分别加入45 ml无机盐液体培养基（DBP、DEHP质量分数均为10 mg/kg） ，以加入等量无菌水为对照。28 ℃、150 r/min避光培养3 d，检测培养基中PAEs含量。选出对PAEs降解效果良好的真菌，按照瑞源生物Yeast Colony Rapid Detection Kit试剂盒方法提取DNA，用通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，扩增产物送至南京擎科生物科技有限公司进行基因测序。

1.3.3 检测方法 培养基中的DBP及DEHP含量采用高效气相测谱仪（GC）检测。DBP检测方法：样品中DBP用二氯甲烷萃取。待测培养基中加入等量二氯甲烷，150 r/min振荡15 min，静置20 min使其分层，收集下层有机相液体。DEHP检测方法：样品中DEHP用正己烷萃取。待测培养基中加入等量正己烷，多管式旋涡混合器涡旋2 min，4 500 r/min离心2 min使其分层，收集上层有机相液体。有机相液体过0.22 μm滤膜，GC检测。

1.4 真菌降解特性研究

1.4.1 真菌对不同质量分数DBP及DEHP的降解 参照方法1.3.2及1.3.3，将 5 ml菌液分别加入 45 ml无机盐培养基（DBP、DEHP质量分数梯度均为5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg） ，以加入等量无菌水为对照，28 ℃、150 r/min避光培养5 d，检测培养基中 PAEs 含量。

1.4.2 真菌降解PAEs广谱性测定 测定真菌对10种PAEs和3种降解中间产物的降解能力，10种PAEs为邻苯二甲酸二烯丙酯（Diallyl phthalate， DAP）、邻苯二甲酸二正辛酯（Dioctyl phthalate， DNOP）、邻苯二甲酸双（2-甲氧基乙酯）（Bis（methylglycol） phthalate， BMEP）、邻苯二甲酸二甲酯（Dimethyl phthalate， DMP）、邻苯二甲酸丁酯苯甲酯（Butyl benzyl phthalate， BBP）、邻苯二甲酸二环己酯（Dicyclohexyl phthalate， DCHP）、邻苯二甲酸二异丙酯（Diisopropylo-phthalate， DIPrP）、邻苯二甲酸二正戊酯（Dipentyl phthalate， DPP）、邻苯二甲酸二乙酯（Diethy phthalate， DEP）、邻苯二甲酸二丙酯（Dipropyl phthalate， DPrP），3种降解中间产物为邻苯二甲酸单丁酯（Monobutyl phthalate， MBP）、邻苯二甲酸（Phthalic acid， PA）、原儿茶酸（protocatechuic acid， PCA）。

3株真菌分别接种于PDA培养基，28 ℃培养5 d，用打孔器打取直径为5 mm的菌饼，分别接种于含不同PAEs的无机盐固体培养基（PAEs质量分数为10 mg/kg），28 ℃避光培养7 d，观察真菌生长情况和菌落形态。以菌落生长直径小于1 mm为不生长（-），大于1 mm小于5 mm为生长（+），超过5 mm为生长旺盛（++）。

1.4.3 真菌对土壤中邻苯二甲酸酯的降解能力 试验所用清洁农田土壤取自江苏省农业科学院试验基地，土壤风干磨碎过2 mm筛，分别加入DBP、DEHP丙酮溶液，配制PAEs质量分数为80 mg/kg的人工污染土壤，各称取50 g加入洁净的玻璃培养皿中，于25 ℃避光条件下老化28 d。将用PDB培养基在150 r/min、28 ℃富集培养的菌液离心，适当稀释控制菌液中含菌量一致，将菌液分别接种至老化后的土壤中，以加入等量无菌水为对照。定期浇去离子水使土壤含水量保持在20%左右，将培养皿于28 ℃恒温培养箱避光培养21 d，取样测定土壤中PAEs含量，计算降解率。降解率=（对照样品残留量-处理样品残留量）/对照样品残留量×100%。土壤中PAEs含量检测参考刘彦爱[19]的方法：准确称取2.0 g土壤，加入2 ml超纯水剧烈涡旋 1 min，加入5 ml色谱乙腈，于多管式旋涡混合器上涡旋振荡10 min，加入0.5 g NaCl和2.0 g无水MgSO4，立即涡旋1 min，3 500 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm有机系滤膜，GC检测。

2 结果与分析

2.1 PAEs降解真菌的分离筛选

通过分离得到11株对DBP及DEHP降解效果较好的真菌，分别命名为PAE1～PAE11，降解效果见表1。根据18s rRNA测序结果序列比对，对11株菌进行了初步鉴定，鉴定结果見表1。菌株PAE1、PAE6、PAE8均对DBP及DEHP有很好的降解效果且为非致病菌。综合考虑降解效果及致病因素，选取3株真菌PAE1、PAE6、PAE8进行后续试验。

2.2 菌株PAE1、PAE6、PAE8的进一步鉴定

菌株PAE1、PAE6、PAE8分别接种于MSM培养基，28 ℃下避光培养7 d，肉眼观察菌落形态（图1）。经比对，菌株PAE1的18S rRNA序列与菌核生枝顶孢霉（Acremonium sclerotigenum）的同源性达99.06%，菌株PAE6的18 S rRNA序列与辐毛鬼伞（Coprinellus radians）的同源性达99.53%，菌株PAE8的18 S rRNA序列与耐盐枝孢菌（Cladosporium halotolerans）的同源性达99.03%。结合系统发育树（图2）与菌株形态特征，将菌株PAE1鉴定为菌核生枝顶孢霉，将菌株PAE6鉴定为辐毛鬼伞，将菌株PAE8鉴定为耐盐枝孢菌。

2.3 3株真菌对不同质量分数DBP及DEHP的降解特性

在DBP和DEHP起始质量分数分别为5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg时，培养5 d后测定不同菌株对MSM液体培养基中PAEs的降解率，结果（图3）显示菌株PAE1对不同质量分数DBP降解率分别为42.3%、53.2%、41.5%，对不同质量分数DEHP降解率分别为26.2%、30.4%、39.4%;菌株PAE6对不同质量分数DBP降解率分别为54.2%、68.4%、45.8%，对不同质量分数DEHP降解率分别为28.2%、26.9%、32.4%;菌株PAE8对不同质量分数DBP降解率分别为49.3%、59.3%、39.4%，对不同质量分数DEHP降解率分别为22.3%、31.3%、26.9%。3株真菌对DBP降解率均在起始质量分数为10 mg/kg时最高，5 mg/kg次之，20 mg/kg最低。菌株PAE8对DEHP的降解效率也在起始质量分数为10 mg/kg时最高。可能是由于高质量分数的PAEs抑制了微生物活性而降低 PAEs 降解率。高质量分数（50 mg/kg）污染处理的DBP及DEHP对微生物生长、土壤酶活性以及土壤基础呼吸[20]有明显的抑制作用，并且抑制作用随着污染物质量分数升高而增强[21]。说明当PAEs对微生物产生毒害作用时，微生物会通过降低生理活动来抵御污染物的胁迫[22]。

3株真菌对DBP的降解率（41.5%～68.40%）均高于对DEHP的降解率（22.3%～39.4%），可能是由于与DBP相比，DEHP侧链较长，更难以降解。据文献报道，微生物对PAEs降解效率受其分子结构的影响，烷基链短、支链小更有利于微生物的降解[23]。

在起始质量分数为20 mg/kg时，菌株PAE1、PAE6对DEHP的降解效率最高，可能是因为2株真菌可耐受20 mg/kg的DEHP。有研究者发现，有机污染物会促进功能微生物生长[24]，当功能微生物受到有机污染物胁迫时，因经过前期的适应，其生长速率明显提高[25]。由此可见，微生物在可耐受的胁迫下能通过提高自身生理活动来抵御胁迫[26-29]。

2.4 菌株PAE1、PAE6和PAE8降解PAEs的广谱性

3株真菌均能在含有不同PAEs MSM固体培养基上生长（表2），PAE6生长最旺盛，PAE1次之，PAE8生长较缓慢。说明3株真菌能降解多种PAEs，对常见的PAEs均有降解能力。3株真菌对支链碳数为1～8的不同PAEs均有降解能力。根据文献报道，已筛选到的PAEs降解真菌对多种不同支链长度的PAEs有降解效果。韩蕊等[18]研究结果表明爪哇正青霉（ Eupenicillum javanicun）菌株对土壤中复合PAEs（ DMP、DEP和DOP） 有較好的降解效果。谢清如等[14]发现黄孢原毛平革菌在最佳条件下对DEP去除率达到94.6%。

2.5 菌株PAE1、PAE6和PAE8降解途径推测

为推测3株真菌对PAEs的代谢途径，将3株真菌接种在添加MBP、PA、PCA的无机盐固体培养基上观察生长情况，发现3株菌株均能以3种代谢中间产物为底物（表2）。根据试验结果与相关文献[10，30-31]，推测3株真菌作用下PAEs的生物降解过程为：PAEs通过脱脂化作用降解为单酯，再进一步水解为PA，最终PA降解形成PCA并进入下一步代谢。 此路径与目前报道的多数微生物降解PAEs的主要路径一致。

2.6 菌株PAE1、PAE6、PAE8对土壤中邻苯二甲酸酯的降解能力

用80 mg/kg DBP和DEHP污染土壤且老化28 d后，分别测定土壤中DBP和DEHP的含量，结果显示DBP含量为1.2 mg/kg， DEHP含量为4.4 mg/kg，且含量保持稳定不再下降。接菌后21 d发现，菌株PAE1、PAE6、PAE8均对土壤中DBP及DEHP有不同程度的降解（图4）。3株真菌21 d内对1.2 mg/kg DBP的降解率为47.2%～70.6%，对4.4 mg/kg DEHP降解率为54.1%～73.4%。PAE6对土壤中PAEs的降解率最高，达70.6%～73.4%。与无机盐培养基相比，3株真菌对土壤中PAEs尤其是对DEHP的降解率高。这可能是由于在自然环境中与在室内培养基试验条件下的差异造成的，也可能是由于试验时间延长使降解率升高。

目前对真菌修复土壤中PAEs的研究大多是在灭菌土壤及高质量分数PAEs污染条件下进行[18，16-17]。而文献报道表明，中国农业土壤中PAEs大多处于微量水平[2]，土壤中优先控制的6种PAEs在山东省寿光市蔬菜大棚中总量范围为0.453～1.615 mg/kg且以DBP与DEHP为主[4]，广东省典型区域92.8%的农业表层土壤中6种PAEs总含量≤1 mg/kg [32]。本试验结果表明，筛选的3株真菌对土壤中较低质量分数的PAEs有良好的降解效果，说明其在自然环境条件下对土壤中PAEs污染具有良好的修复作用。枝孢菌属（Cladosporium）真菌可参与修复PAEs污染土壤已有相关报道[33]，但本研究首次发现枝顶孢霉属（Acremonium）真菌及鬼伞属（Coprinellus）真菌具有修复有机污染物污染土壤的功能。

3 结论

从PAEs污染的棉田土壤中筛选出3株可同时降解多种PAEs的高效降解真菌PAE1、PAE6、PAE8，分别鉴定为菌核生枝顶孢霉（Acremonium sclerotigenum）、辐毛鬼伞（Coprinellus radians）、耐盐枝孢菌（Cladosporium halotolerans）。3株真菌对无机盐培养基中不同质量分数DBP及DEHP具有良好的降解效果，对DBP的降解率为39.4%～68.4%，对DEHP降解率为22.3%～39.4%，其中3株真菌在DBP起始质量分数为10 mg/kg时降解率最高，PAE6降解率达68.4%。

3株真菌均能降解多种PAEs，并推测其生物降解途径为：PAEs→单酯→PA→PCA→CO2+H2O。3株真菌对DBP及DEHP污染土壤具有良好的修复作用，21 d内对1.2 mg/kg DBP的降解率为47.2%～70.6%，对4.4 mg/kg DEHP的降解率为54.1%～73.4%，其中PAE6对土壤中DEHP的降解率最高，达73.4%。

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（责任编辑：张震林）