黑老虎花总黄酮超声辅助提取工艺优化及其抗氧化性研究

李亚军，易 鹊，杨军衡，邓小美，梁忠厚,2,

（1.湖南环境生物职业技术学院医药技术学院,湖南衡阳 421005；2.湖南环境生物职业技术学院园林学院,湖南衡阳 421005）

黑老虎（Kadsura coccinea（Lem.））为南五味子属（KadsuraKaempf.ExJuss.）藤本植物，又称过山风、红钻、冷饭团等，在我国常见于湖南、海南、江西、广西等地[1]。黑老虎根、茎及果实具有行气活血、通经止痛等作用，在民间广泛用于治疗关节肿痛及妇科疾病等，为苗族及侗族等少数名族中常用的一味野生药材[2]。黑老虎含有多种化学成分，如木脂素[3]、三萜类[4]、黄酮类[5]及甾体类[2]等，除此之外，其果实含有大量微量元素、维生素等营养物质[6]。药理活性研究表明，黑老虎根、茎及果实中的化学成分具有抗肿瘤[7]、抗氧化[8]、降血脂[9]、抗HIV[10]、保肝[11]等多种生物学活性。从数据分析来看，目前关于黑老虎成分的研究主要集中在其根、茎及果实[3−11]。近年来，湖南省通道县通过引种野生黑老虎，并且大面积种植获得药食同用的黑老虎果的方式走上了脱贫致富道路。黑老虎仿生态种植的研究成为热点[12]，但是黑老虎花却随着生长凋谢而浪费。目前关于黑老虎花中有效成分提取及药理活性研究未见报道。因此，研究黑老虎花中具有生物活性的天然成分是提高黑老虎不同部位资源利用、减少环境污染的重要途径。该方面的研究也能够辅助并推进该药用植物的栽培、采摘、二次利用等方面的开展，从而促进湖南仿生态药用资源废弃物在食品抗氧化剂方面的合理开发。

黄酮为具有2-苯基色原酮的一大类天然化合物，在植物的花、叶及果实中含量较高[13]。大量的研究发现，天然黄酮类化合物具有抗氧化[14]、抗肿瘤[15]、抗炎[16]等作用。超声提取法具有提取方法简便、提取溶剂用量少及提取效率高的优点，已广泛用于黄酮类化合物的提取。目前，关于黑老虎花中黄酮的超声辅助提取及抗氧化活性的研究未见报道。本研究以高效环保的超声辅助提取法为手段，比较不同生长期黑老虎花中总黄酮含量的差异，优化最佳提取工艺条件；此外，测试了其抗氧化能力，以期为民间草药黑老虎的多部位综合利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑老虎花 分别于4 月份（花蕾期）、6 月份（全开期）采摘于湖南环境生物职业技术学院，仿生态林下种植基地内，经鉴定为五味子科（Schisandraceae）南五味子属（Kadsura Jussieu）植物黑老虎（Kadsura coccinea）[1];芦丁标准品（HPLC≥98%）上海源叶生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、维生素C、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）国药集团化学试剂有限公司。

UC4120 超声波清洗仪 朗杰超声仪器有限公司；FA-2004 电子分析天平 赛多利斯公司；R201D旋转蒸发器 杭州大卫科教仪器有限公司；UV-2600 紫外可见分光光度计 SHIMADZU/岛津；CGCG-9160 粉碎机 中山市长柏电子有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黄酮提取工艺流程 采摘新鲜黑老虎花于太阳下晒1 h，50 ℃下烘干至恒重，粉碎后过60 目筛得黑老虎花粉末。称取2 g黑老虎花粉末，石油醚脱脂，一定条件下超声辅助提取，过滤，提取液浓缩后用70%乙醇溶解后定容于100 mL容量瓶中，得样品溶液。

1.2.2 芦丁标准曲线的制备 根据NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法[17]，电子分析天平称取20 mg芦丁标准品，少量溶剂溶解，定容于100 mL容量瓶中。移取0、2、4、6、8、10 mL的标准品溶液于6 个50 mL容量瓶中。按顺序加入5% NaNO2、10% Al（NO3）3各2 mL，每次加入试剂后摇匀，反应6 min；然后再加入20 mL的4% NaOH，70%乙醇定容，摇匀后静置15 min。在波长为505 nm处测定吸光度。以吸光度（A）为纵坐标，芦丁溶液浓度C（μg/mL）为横坐标制作标准曲线：y=0.01205x−0.0010，R2=0.9994。

1.2.3 总黄酮得率测定 取1.2.1 中的样品溶液2 mL，依照1.2.2 方法测定吸光度，并将结果代入标准曲线计算黄酮浓度C（μg/mL）。通过以下公式计算总黄酮提取量（mg/g）：提取量=C×n×V×10−3÷m，式中，V：提取液体积（mL），n：稀释倍数，m：黑老虎花粉末质量（g）。

1.2.4 采摘花期的确定 比较花蕾期和全开期总黄酮得率差异：按照1.2.1 的方法，在一定超声频率下，分别以4 月份（花蕾期）、6 月份（全开期）随机采收的黑老虎花为原材料，60 ℃、35 min、1∶20 g/mL、60%乙醇进行超声辅助提取，确定最佳采收时间。

1.2.5 单因素实验 选择最佳采摘期的黑老虎花为原料，称取干燥好的黑老虎花粉末2 g，60%乙醇为提取溶剂，料液比为1:20 g/mL，60 ℃下提取35 min。基于以上设置，在其他3 个条件不变的情况下，根据以下参数进行单因素实验。超声时间：15、25、35、45、55 min；料液比：1:15、1:20、1:25、1:30、1:35 g/mL；乙醇浓度：50%、60%、70%、80%、90%；超声温度：35、40、50、60、70、80 ℃。

1.2.6 正交试验 基于单因素实验情况，正交试验相关情况如表1 所示，采用L9（34）正交试验进行优化，总黄酮提取率(Y)作为评价指标[18]。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.7 抗氧化测试

1.2.7.1 清除DPPH自由基能力 根据文献报道的方法，取最优条件下提取的黑老虎花总黄酮浓缩液，稀释成0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL的9 个待测试溶液[19]。准确量取以上测试溶液 0.6 mL，分别加入一定浓度DPPH溶液2.4 mL，摇匀，反应30 min，最大吸收波长处测定吸光度，按照下式计算清除率。该实验以抗维生素C为参照物。

DPPH自由基清除率（%）=（A对照−A样品+A空白）÷A对照×100

1.2.7.2 清除ABTS自由基能力 根据文献报道的方法，将最优条件下提取的黑老虎花总黄酮浓缩液，稀释成0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL的9 个待测试溶液[20]。量取以上测试溶液，各加入一定浓度ABTS溶液，摇匀，反应10 min，最大吸收波长处测定吸光度，按照下式计算清除率。该实验以抗维生素C为参照物。

ABTS自由基清除率（%）=（A空白−A样品）÷A空白×100

1.3 数据处理

实验平行测定3 组，取平均值。采用Microsoft Excel 2016、SPSS 22.0 软件进行绘图、数据处理等。

2 结果与分析

2.1 采摘花期的确定

由图1 可知，黑老虎在花蕾期总黄酮提取量为（6.25±0.05）mg/g，全开期总黄酮提取量为（9.97±0.06）mg/g。显著性分析结果为P<0.01，表明采收花期对黑老虎花总黄酮得率的影响显著。当黑老虎花全开后，总黄酮得率明显高于花蕾期。有相关研究表明，植物中总黄酮含量与植物生长时间有一定的关系[21]，所以后续的实验均以采摘于全开期（6 月份）的黑老虎花为原料。

图1 黑老虎花不同花期总黄酮提取量测试结果Fig.1 Results of total flavonoids yield in different florescence of Kadsura coccinea flowers

2.2 单因素实验

2.2.1 不同超声时间对提取量的影响 如图2 所示，在25 min前，黑老虎花总黄酮提取量增加缓慢，25～45 min黄酮提取量大幅上升，在45 min达到最大值10.63 mg/g；继续提取，总黄酮提取量有所降低。短时间内提取，随着时间的增加溶剂的渗透及扩散作用增强，从而导致得率的增加；当提取完全后，继续加热可增加杂质的溶出率而导致得率下降；其次，加热提取时间过长，也可能造成黄酮结构的破坏而导致得率下降[22]。因此，优化实验范围为35、45、55 min。

图2 不同超声时间对黑老虎花总黄酮提取量的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on the yield of total flavonoids from Kadsura coccinea flowers

2.2.2 不同乙醇浓度对提取量的影响 如图3 所示，在乙醇浓度低于80%，随着乙醇浓度的增加，黑老虎花总黄酮提取量逐渐上升，在80%时得率最大为14.25 mg/g；当乙醇浓度大于80%后，提取量大幅下降。该现象可能是由于黑老虎花中的黄酮类大多以苷的形式存在，极性与80%的乙醇相似，所以在80%乙醇中溶解度最大[23]。当乙醇浓度再增大时，原料中总黄酮的溶解度下降，而其他极性较大杂质溶出量增大，从而使总黄酮提取量降低。优化条件选择为75%、80%、85%。

图3 乙醇浓度对黑老虎花总黄酮提取量的影响Fig.3 Effect of concentration of ethanol on the yield of total flavonoids from Kadsura coccinea flowers

2.2.3 不同料液比对得率的影响 如图4 所示，料液比在1:15～1:25 范围内，总黄酮得率随着溶剂用量的增加逐渐增大，在1:25 处得率达到峰值12.37 mg/g，然后随着溶剂用量的增加得率反而下降。这可能是在1:25 之前，溶剂用量未达到饱和，所以得率随着溶剂用量的增加而增大[24]。当料液比已达到饱和状态，继续增加溶剂用量，其他可溶性杂质的提取量增大，所以总黄酮得率反而降低。因此，优化实验选择为1:20、1:25、1:30 g/mL。

图4 料液比对黑老虎花总黄酮提取量的影响Fig.4 Effect of material liquid ratio on the yield of total flavonoids from Kadsura coccinea flowers

2.2.4 不同超声温度对得率的影响 如图5 所示，60 ℃以前，随着温度的增加，总黄酮得率大幅度提升，在60 ℃时达最大值9.97 mg/g；当温度高于60 ℃后，随着温度的增加，得率逐渐下降。分子运动速度与温度相关，随着温度的升高，分子运动加快。因此，温度的升高加快了溶剂分子在植物细胞内外的往返运动；但是温度太高，则可能破坏黑老虎花中黄酮的结构，从而导致得率下降。所以优化实验条件为55、60、65 ℃。

图5 超声温度对黑老虎花总黄酮提取量的影响Fig.5 Effect of extraction temperature on the yield of total flavonoids from Kadsura coccinea flowers

2.3 正交试验

由表2 可知，各因素对总黄酮得率的影响大小如下：超声时间（A）>料液比（B）>超声温度（D）>乙醇浓度（C）。最优工艺条件为A2B3C3D2，即超声时间为45 min、料液比1:30 g/mL、乙醇浓度85%、超声温度60 ℃。此条件下黑老虎花总黄酮得率为（19.25±0.12）mg/g。由表3 可知，各因素对黑老虎花总黄酮提取影响显著（P<0.05）。

表2 正交试验结果Table 2 Results for orthogonal test

表3 正交设计方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal design

2.4 抗氧化测试

2.4.1 清除DPPH自由基能力 由图6 可知，在测定浓度范围内，黑老虎花总黄酮清除DPPH自由基的能力逐渐增大，与浓度成量效关系。在0.8 mg/mL处，清除率为82.1%，相当于该浓度下维生素C抗氧化能力的87.9%。通过SPSS 20.0 软件进行数据分析得黑老虎花总黄酮及VC对DPPH清除率的IC50值分别为0.13、0.093 mg/mL，铁皮石斛花[25]对DPPH自由基抑制能力的IC50为1.01 mg/mL，说明黑老虎花总黄酮具有较好的清除DPPH自由基作用。

图6 黑老虎花总黄酮对DPPH自由基抑制作用Fig.6 Inhibitory effect on DPPH free radical of total flavonoids from Kadsura coccinea flowers

2.4.2 清除ABTS自由基能力 由图7 可知，在测试浓度范围内，黑老虎花总黄酮对ABTS自由基抑制作用逐渐加强，这也说明，植物中总黄酮抗氧化活性与其含量相关[26]。在0.4 mg/mL时，清除率达到最大值94.7%，清除能力与维生素C相当（96.1%），通过SPSS 20.0 软件进行数据分析得黑老虎花总黄酮及VC对ABTS清除率的IC50值分别为0.046、0.035 mg/mL，虽然清除能力低于VC，但该提取物也具有较强的清除ABTS自由基能力。黑老虎花中的黄酮类化合物具有抗氧化作用可能是由于其结构上存在羟基，其能够通过与自由基发生化学反应，干扰自由基链式反应发生，从而产生抗氧化作用[27]。

图7 黑老虎花总黄酮对ABTS自由基清除能力Fig.7 Scavenging ability on ABTS free radical of total flavonoids from Kadsura coccinea flowers

3 结论

采用超声辅助提取黑老虎花总黄酮，通过单因素确定黑老虎花在全开期时（6 月份）黄酮含量更高，又通过正交试验优化其工艺条件：黑老虎花全开期采摘，超声时间45 min、料液比1:30 g/mL、乙醇浓度85%、超声温度60 ℃，最优条件下提取量为（19.25±0.12）mg/g。黑老虎花总黄酮在浓度为0.8 mg/mL时，对DPPH自由基清除率为82.1%，IC50为0.13 mg/mL；在浓度为0.4 mg/mL时，其对ABTS自由基的清除率达到最大值，与维生素C清除DPPH自由基能力相当，IC50为0.046 mg/mL。实验结果表明黑老虎花中总黄酮具有较强的抗氧化能力，可开发为天然抗氧化剂。