基于DNA条形码的四川老君山国家级自然保护区尺蛾科昆虫种类鉴定

王红梅， 张雪莲， 王磊， 岳碧松， 冯盛林， 陈本平， 孟杨, 2*

(1. 四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都610065； 2. 四川大学自然博物馆，成都610065； 3. 四川省屏山县老君山国家级自然保护区管理局，四川屏山645350)

昆虫是种类最多的动物类群，同时也对生态系统功能和全球经济有着重要作用(师丹，2009)。在生态系统中，昆虫往往与其他生物相互依存，尤其是鸟类和植物(栾天宇，2017)。在保护区中昆虫作为生物资源的重要组成部分，了解其本底对于保护区的资源利用和生态环境监测等方面都具有重要意义(查玉平，2005)。四川老君山国家级自然保护区是以保护四川山鹧鸪Arborophilarufipectus、白腹锦鸡Chrysolophusamherstiae、白鹇Lophuranycthemera和红腹角雉Tragopantemminckii等雉科Phasianidae鸟类，以及其伴生的珍稀野生动植物和亚热带阔叶林生态系统为目的的森林和野生动物类型自然保护区。保护区内生物资源丰富，植物、兽类和鸟类的生物资源都经过了较为详细的调查(杨杰等，2007；廖文波，2010；伍自力等，2015；何云玲等，2016)，但尺蛾科Geometridae昆虫作为生物资源的组成部分还未经过详细调查。

尺蛾科Geometridae隶属于鳞翅目Lepidoptera尺蛾总科Geometroidea。尺蛾科是鳞翅目的第二大科，目前已描述的尺蛾接近23 000种，分布在除少数极地地区外的世界各地(Scoble & Hausmann，2007)。中国尺蛾科昆虫种类十分丰富，目前已记载了3 800种以上(姜楠，2013)。尺蛾多以树木为食，在森林生态系统中多样性较高，对环境变化非常敏感，可作为环境监测的重要指标(韩红香，2005；班晓双，2017)。

Hebert等(2003a，2003b)对动物界11个门的13 320个物种线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome oxidase subunit Ⅰ，COⅠ)基因近5’端一段长度为658 bp的片段比对研究，发现这段序列相对保守又具有高变异性，认为该基因片段可以用于物种鉴定，并提出了DNA条形码技术。DNA条形码是一段相对标准化短基因片段，DNA条形码技术通过对这一段相对标准化的基因片段测序分析后，进行个体物种鉴定、系统进化发育研究、隐存种和新种发现等分析研究(Hebertetal.，2004a；Parketal.，2011；Chestersetal.，2012)。目前DNA条形码技术已广泛应用到昆虫、鸟类、哺乳动物等类群的物种鉴定中(Hebertetal.，2004b；宋韶彬等，2014；Caietal.，2016；杨瑞生等，2017；Liuetal.，2018)。在昆虫的分子鉴定中，目前被广泛接受的分子标记是COⅠ基因。

本研究基于DNA条形码技术分析保护区灯诱采集的尺蛾科昆虫资源，为保护区尺蛾科昆虫资源提供相关资料，同时为其资源利用与管理提供依据。

1 研究地概况

四川老君山国家级自然保护区位于四川盆地南缘宜宾市屏山县境内中部，属于凉山山系，东西长约11.6 km，南北宽约7.4 km，总面积约为35 km2，海拔800～2 008.7 m。该地区属亚热带温润季风气候区，四季分明，雨量充沛，雨热同季，年均气温12～14.7 ℃，年平均变幅小，年均湿度在85%以上，7—10月多在88%～92%(杨杰等，2007)。植被以阔叶林为主，包括亚热带常绿阔叶林和亚热带山地常绿、落叶阔叶混交林，海拔1 500 m以上分布了大面积原始常绿阔叶林，人为干扰较少，海拔1 500 m以下主要分布次生林和一定面积的人工林，人为干扰较大(西丽媛子等，2020)。

2 材料和方法

2.1 样本采集

2019年6—8月和2020年5—6月用黑光灯灯诱采集，采样地点为新田咀保护站(104.072 19°E，28.683 73°N，海拔1 101 m)、二埝坪观测站(104.159 00°E，28.431 00°N，海拔1 536 m)和烂池子(104.036 00°E，28.730 40°N，海拔886 m)。经过展翅、整姿和烘干定型后，标本保存于四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室。

2.2 DNA提取、PCR扩增及测序

依据形态将2 402号尺蛾科标本初步分为252组，每组选取1～3只，取样本腿部肌肉组织放置于1.5 mL无菌EP管中进行实验。按照动物通用DNA提取试剂盒说明书提取样本的总DNA(北京擎科，货号：TSP201)，-20 ℃保存备用。使用通用引物扩增COⅠ基因LC01490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，HC02198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’(Folmeretal.，1994)。取PCR产物5 μL，以标准DNA Marker为参考，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，产物条带清晰单一，产物长度与预期一致送至北京擎科生物科技有限公司成都分公司进行双向测序。

2.3 数据分析

测序结果用DNASTAR Lasergene v7.1 Seqman查看峰图质量并进行人工校正和拼接，导出为fasta格式。通过MEGA 7.0分析计算序列碱基组成，统计保守位点(C)、变异位点(V)、简约信息位点(Pi)和单态位点(S)等的数量；结合BOLD和GenBank数据库中相关属种的COⅠ基因序列，基于Kimura 2-parameter(K2P)模型，计算遗传距离。

使用BOLD Systems v4数据库，根据Ratnasingham和Hebert(2007)的方法进行物种鉴定，认为大多数动物的参考阈值是3%，选择相似度≥97%的匹配结果，结合该序列在BOLD数据库中的形态记录(http://www.boldsystems.org/index.php/TaxBrowser_Home)，确定种名(Muhammadetal.，2018)；若相似度<97%，根据数据库给出的与查询样本关系最近的100条序列的分类信息，将样本只确定到科或属的水平，避免误鉴。即若与其关系最近的100条序列均隶属于尺蛾科，则该序列也隶属于尺蛾科，并结合ID页给出的查询样本与其关系最近的100条序列构建的NJ树来判断。

采用构建NJ树和ABGD在线工具(https://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/abgd/abgdweb.html)对只确定到科或属水平的序列进行物种界定(Puillandreetal.，2012；李晶等，2013；杨倩倩等，2018)。用MEGA 7.0基于K2P模型，构建NJ树，检验支持率的重复性抽样次数为1 000，聚到同一支的序列认为是同一个物种。在ABGD网站提交只鉴定到科、属水平的序列，最小相对gap宽度值X设为1.0，其余参数为默认值，模型选择K2P，进行物种划分，划分到同一组的样本认定为同一个物种(邢树文等，2019)。

3 结果

3.1 COⅠ基因碱基组成

共采集到2 402号标本，获得了297条鳞翅目尺蛾科COⅠ序列，经Clustal W比对后获得658 bp等长片段。利用MEGA 7.0以无脊椎动物密码子表翻译成氨基酸序列后，序列中没有插入、缺失、删除或终止密码子，说明所有序列均为功能性线粒体COⅠ基因。297条序列A、T、G、C的平均含量分别为31.0%、39.2%、14.9%、14.8%，A+T含量为70.2%，G+C含量为29.7%，表现出AT偏向性，符合昆虫线粒体基因组A+T含量较高的特点(Simonetal.，2006)。检测到保守位点361个，变异位点297个，简约信息位点271个，单态位点26个，变异位点的占比为45.1%。

3.2 物种界定结果

通过BOLD数据库比对297条序列，140条序列鉴定到种，隶属于74属95种，60条序列鉴定到属水平，97条序列只鉴定到科水平。

以鞘翅目Coleoptera物种Contacyphonpadi(GenBank登录号：KM286254.1)和欧洲深山锹甲Lucanuscervus(GenBank登录号：KM286254.1)为外群，157条只鉴定到科或属的序列构建NJ树。结果显示，157条序列划分成96个单系，聚在一起的支持率均大于99%。ABGD的划分结果分为初始划分和递进划分。递进划分在P值为0.001时划分成100组，P值为0.001 7、0.002 8和0.004 6时划分成99组，P值为0.007 7时划分成98组，P值为0.012 9、0.021 5和0.035 9时划分成96组；而初始划分结果稳定，不同的P值均划分成96组(图1)。选择初始划分结果作为物种划分结果，结果与NJ树的聚类结果一致，呈现对应关系(图2)。通过构建NJ树和ABGD在线工具将60条鉴定到属的序列划分成35种，隶属于31属；97条鉴定到科的序列划分成61种。

297条序列隶属于191种，鉴定到种和属水平的序列隶属于92属(表1)。

表1 四川老君山国家级自然保护区尺蛾科昆虫名录 Table 1 Directory of Geometridae in the Laojunshan National Nature Reserve， Sichuan

续表1

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3.3 遗传距离分析

从BOLD和GenBank数据库中下载本文涉及的相关物种COⅠ序列用于遗传距离分析，除去序列较短长度低于500 bp的序列，共有70条序列用于分析两两遗传距离，隶属于46属55种。基于K2P模型计算367条序列的两两遗传距离，发现种内遗传距离最小为0，最大为4.36%，平均种内遗传距离为0.63%，褐缘白短尾尺蛾Ourapteryxsimilaria种内遗传距离最大；种间遗传距离最小为3.43%，最大为19.12%，黑刺斑黃尺蛾Opisthograptismoelleri和Geometridae sp.18之间为最大种间遗传距离，平均种间遗传距离为11.91%，平均种间距离是平均种内距离的18.9倍(图3)。

4 讨论

在昆虫的实际研究中，常常会收集某个特定区域内的昆虫，其种类繁多，隶属于不同的目、科。大多数昆虫处在不同的发育阶段，形态变化较大，亲缘关系较近的昆虫形态相似；昆虫中普遍存在雌雄二型现象(王孟卿，杨定，2005)，这对于非分类学专家来说很难对其进行准确的形态学鉴定，对于分类学专家来说也是巨大的工作量。随着DNA条形码技术的提出，有效解决了这一问题，通过对特定的基因片段的测序和比对，较容易确定样本的分类地位。

本研究采集了2 402号尺蛾科昆虫标本，获得了297条COⅠ基因序列，隶属于191种。有95种鉴定到种水平，占总物种数的49.74%；35种只鉴定到属水平，占18.32%；61种只鉴定到科水平，占31.93%；未确定到种的物种数占50.26%。与传统昆虫的鉴定方法相比，分子鉴定的效率很大程度上取决于基因数据库的信息量，数据库中包含的物种基因信息量越大，DNA条形码的鉴定效率和准确性越高。截止到2020年9月，BOLD数据库中公开了尺蛾科的124 801条COⅠ基因序列，隶属于12 110种，约占目前已知尺蛾科物种数的52.65%，还有许多尺蛾科物种缺少DNA条形码数据。由此可见BOLD DNA条形码数据库中尺蛾科部分还有很多信息尚未完善，今后需要大量相关工作。

根据条形码构建NJ树来确定样品的物种，方法简单、结果直观，这一方法在不同的分类群中取得了较理想的结果。Hajibabaei等(2006)鉴定热带鳞翅目昆虫时发现，NJ树的鉴定准确率高达97.9%。本研究构建NJ树对未鉴定到种的序列进行聚类分析时发现，聚在一起的单支支持率均大于99%，表明其划分结果可信度高，该结果与ABGD的划分结果一致。能否准确区分物种依赖于所选分子标记的物种种间遗传距离和种内遗传距离之间的分离程度，物种的遗传距离存在条码间隙，即物种的最大种内遗传距离小于最小种间遗传距离(Hebertetal.，2004b)。在本研究中，尺蛾科的平均种间遗传距离是平均种内遗传距离的18.9倍，符合Hebert等(2004b)提出的10×原则，关注种内遗传距离较大的物种，比如褐缘白短尾尺蛾Ourapteryxsimilaria，其最大种内遗传距离仍小于最小种间遗传距离，存在条码间隙，仍可以将它与其他物种准确的区分出来，说明以COⅠ基因作为分子标记的DNA条形码技术可以对本研究中尺蛾科昆虫进行有效分析。

四川老君山国家级自然保护区内鳞翅目尺蛾科昆虫资源丰富，尺蛾科昆虫种类的调查是研究其系统发育关系和地理亲缘关系的重要资料。本研究只采集了5—8月的鳞翅目尺蛾科样本，缺少其他月份的鳞翅目尺蛾科的种类，之后还需要继续调查、补充该地区鳞翅目尺蛾科昆虫DNA条形码，构建一个较为完整的保护区尺蛾科昆虫DNA条形码数据库，为其保护与利用提供依据。