吲哚菁绿在生物成像与医学工程中的应用进展

周巧雨，许佳佳，刘 敏，马 鑫，黄雨柔，吴彦东，陈 琼，尹 军

华中师范大学化学学院农药与化学生物学教育部重点实验室，湖北 武汉 430079

近年来，光学染料发展迅速，大量的荧光染料被用于生物成像及疾病的诊断与治疗[1]。其中，一种阳离子型花菁染料吲哚菁绿(indocyanine green，ICG)(图1)引起了科学家的广泛关注。作为一种具有近红外(near-infrared，NIR)吸收和发射的医用水溶性荧光染料，ICG的自荧光弱、干扰低、毒性小、亲和力高、易与蛋白结合形成非共价荧光复合物[2, 3]。因此，其也被美国食品药品监督管理局(FDA)批准可于临床使用[3-5]。为使读者了解ICG的特性，本文介绍了ICG在临床医学中的发展情况，并重点描述了其在肿瘤成像与治疗方面的应用。

图1 ICG的结构式

1 临床应用

1.1 肝脏手术

目前，肝脏手术中仍存在较多致死性并发症(如肝衰竭、小肝综合征等)。而在手术期间，部分检测手段耗时较长，难以及时在术中提供相关病情信息[6,7]。因此，开发一种能快速准确评估肝功能的检测工具具有重要意义。大量的研究显示，ICG的血液清除率与肝功能直接相关[8]，目前大部分医院即是通过近红外光谱法测定ICG浓度，进而评估患者肝功能。为了扩展该方法，2018年，Audebert等[9]提出了从肝细胞到胆小管的ICG非线性排泄速率模型。此外，ICG也被用于肝癌识别：2012年，Kokudo等[10]偶然发现利用ICG进行常规肝功能测试的肝癌病人癌组织会发出强烈的荧光，深入研究显示，由于胆汁排泄紊乱，ICG可通过静脉摄取被保留在高分化或中分化的癌组织中；虽然低分化肝癌及转移性肝癌部位不吸收ICG，但其周围的非癌组织可吸收ICG形成荧光环，进而指示肝癌。

1.2 血管造影

20世纪70年代初，Flower利用ICG可浸润脉络膜基质的特点使用具有近红外发射的ICG可视化脉络膜循环，20年后，ICG血管造影法成为该领域公认的研究方法[11,12]，目前，将不同视网膜和脉络膜层的荧光叠加，并与数字成像系统链接的常规眼底照相机已经开始为血管成像提供高质量的荧光图片。此外，ICG还被用于术中血管成像，如Raabe等[13]向病患静脉注射ICG，随后以近红外激光激发，并用数字摄像机记录其信号，成功观察到眼外血管流动和组织灌注。然而，该方法的实用性不高，患者样本少。为了解决该问题，近期，Reshetnyak团队利用更常见的临床内窥镜和开放手术的Stryker成像仪成像血管(图2)[14]。

图2 (A)血管的荧光图像；(B)血管的彩色图像[14]

1.3 胆道手术

1931年，术中胆道造影(IOC)被首次报道，随后这一技术迅速发展，几乎成为了胆囊切除术中胆管成像的唯一方法。然而，这种方法操作时间长，有可能引起胆道损伤。与之相比，ICG参与的荧光胆道造影术则更具优势：静脉注射ICG后，分子可通过近红外光勾勒出胆道的解剖轮廓，并可在肝外胆管的剥离过程中实时识别肝外胆管避免胆道误损伤，而且医生及病人均不会受到辐射伤害[15]。随着微创手术视频成像技术的发展，ICG近红外荧光显像被引入腹腔镜手术(如急性胆囊炎、肝门胆管切除、胰腺肿瘤切除等)，以提供详细的相关信息(图3)[16]。

图3 (A)ICG荧光胆道造影；(B)胆囊管图片[16]

1.4 肠道成像

ICG可评估直肠手术中吻合口灌注情况，降低吻合口瘘的发生率[17]，起到预警作用，还可以识别病灶位置，检测前哨淋巴结[18]。在结直肠癌切除手术中，ICG会在代谢较差的肿瘤部位积累，辨别待切除的肿瘤边界，提高手术的准确率[19]。虽然近年来ICG成像技术发展迅速并已应用于部分手术(图4)，但现有的研究显示，该技术的应用尚处于初级阶段，且ICG一旦流出极有可能污染手术视野。未来还需将其与分辨率更高的设备联用，并确定试剂的最佳用量及注射部位，保证其在手术过程中的长期稳定性。

图4 结肠切除术中ICG增强的荧光淋巴结成像

2 肿瘤诊断治疗

2.1 肿瘤成像

Kokudo等[10]早在2012年就发现了ICG在肝癌成像中的潜力，这种方法不仅可以快速识别肝癌细胞，还能检测手术后肝脏表面残存的癌细胞。同年，Yokoyama等[20]发表了在术中利用ICG诊断胰腺癌的研究论文。尽管ICG荧光成像在肿瘤切除手术中得到了广泛应用，但其仍然存在特异性低、清除率高、半衰期短等问题。为了解决这些问题，Cheng小组同通过简单的一步油包水乳液法合成了ICG-聚己内酯(PCL)胶束，由于纳米颗粒独特的药代动力学特性及渗透保留效应，这种荧光胶束可在肿瘤部位至少保留4天，且与游离ICG相比，其信噪比可增加5倍以上(图5A)[21]。为了打破ICG成像深度的限制，Changalvaie等[22]将目光转向可避免光散射且可突破光学成像深度的光声成像，该团队首次将ICG的J聚集体封装在丙交酯-乙交酯-b-聚(乙二醇)(PLGA-b-PEG)中合成ICGJ@PEI。在该设计中，J聚集体展现出比单ICG更强的光稳定性和更远的发射，同时脂质体的静电力吸附可以防止ICG降解，此外，分子还可与表皮生长因子受体(EGFR)特异性单克隆抗体结合，提高分子的癌细胞靶向性(图5B)[22]。除了封装ICG，合成性能更强的衍生物也有利于光声成像。有研究显示，ICG的衍生物IR820含有两个磺酸基团，拥有更强的蛋白质结合能力，与人血清白蛋白结合后，IR820单键旋转被限制，荧光迅速增强[23]。因此，该络合物被用于监测血管系统、淋巴引流系统及肿瘤血管，并可作为一种多功能双模态成像探头，对荷瘤小鼠进行近红外及光声成像[23]。与此同时，还有一些研究者致力于改善近红外信号收集系统，如Hu等[24]开发了一种高灵敏度、高分辨率的多谱荧光成像仪，并证明了该仪器可以进行多窗口成像，指导肿瘤切除手术。

图5 (A)与ICG及ICG-PCL胶束作用后，皮下A549肺肿瘤小鼠的荧光图像[21]；(B)ICGJ@PEI存在时，乳腺癌细胞的光声图像[22]

2.2 肿瘤治疗

传统的癌症治疗手段包括外科手术、化疗、放疗等，但这些方法的毒副作用强，治疗效果不理想[25]。近年来，一些新兴治疗策略的发展为癌症的有效治疗提供了新途径，例如，在近红外光照射下，利用光转换产生的高温或活性氧破坏癌细胞结构的光热疗法(PTT)及光动力疗法(PDT)。

由于ICG是一种几乎无毒的近红外临床造影剂，与现有光敏剂相比，其组织穿透性更强，因此也被用于各种肿瘤的PDT及PTT。Tamai等[25]利用超碳酸盐磷灰石(sCA)装载ICG，并通过EPR效应使其聚集在肿瘤部位。结果显示，注射4 h并经近红外光辐射后，与纯ICG组相比，其在肿瘤中的荧光信号增长了4倍，活性氧产率也更高，经19天治疗后小鼠肿瘤体积大大减小，仅为对照组的1/6。然而，随着研究的深入，科学家发现PDT光敏剂产生的大量活性氧有可能会损伤肿瘤周围的正常组织，且现有激光的穿透力不够强，PDT对肿瘤的治疗效果不彻底。因此，一些研究人员积极寻找并陆续开发了具有高抗癌效率的PTT试剂。2019年，Gao等[26]将ICG、疏水热休克蛋白(HSP)、抑制剂GA、亲水葡萄糖氧化酶GOx封装在热敏脂质体中，合成了低温PTT粒子，实验结果显示：静脉注射脂质体(GOIGLs)后，近红外激光触发ICG的光热效应导致温度上升，GOx、ICG、GA会被快速释放，随后，GA进入细胞质并与癌细胞中过表达的热激蛋白HSP90结合，进而抑制细胞的耐热性，提高光热治疗效率。同时，GOx促进葡萄糖消耗、催化H2O2生成羟基自由基，前者导致三磷酸腺苷(ATP)供应减少，抑制HSP；后者产生的羟基自由基进一步破坏癌细胞。由于热激蛋白抑制剂的引入，这一光热疗法在低温下展现出高转换效率。考虑在上述方法中ICG利用效率不够高，光漂白速率过快，Yeroslavsky等[27]进一步合成了封装包括ICG在内的两种近红外染料的聚(乙二醇)-嵌段-聚(ε-己内酯)(PCL-PEG)基胶束(IIPM)。由于染料间的荧光共振能量转移可以减少供体的激发态寿命，降低其光分解效率，因此，在近红外光辐射下，该胶束在体内稳定积累，并展现出高效的抑癌能力(图6)[27]。

图6 (A)MCF-7细胞与IIPM孵育后的存活率；(B)注射IIPM小鼠的活体成像[27]

除上述方法外，将依靠自身免疫系统抑制或杀死癌细胞的免疫治疗法与PDT、PTT等结合，以组建联合抗癌平台的策略也得到了快速发展。例如，Chen等[28]利用ICG、咪喹莫特及PLGA，设计了一种集PTT与免疫检查点封锁(ICB)功能为一体的纳米粒子PLGA-ICG-R837，该粒子不仅能够有效治疗癌症，还可抑制转移、防止肿瘤复发(图7)。为了进一步提高肿瘤小鼠生存率，Wang等[29]将二硬脂酰磷脂酰乙醇胺DSPE-PEG-马来酰亚胺和ICG组装到上转换纳米颗粒中，并加载光敏剂玫瑰红，合成了新型光触发抗原捕获纳米平台。一方面，该粒子联合了光热、光动力和免疫学治疗，为转移性肿瘤的治疗提供了一种新的途径;另一方面其还促进了小鼠的长期免疫记忆功能，有效延长了小鼠寿命。2020年，Feng等[30]报道了ICG模板自组装纳米药物策略，该研究显示，紫杉醇与ICG形成的纳米粒子被肿瘤细胞有效摄取后，ICG利用PDT诱导肿瘤细胞免疫原性死亡，而紫杉醇则抑制调节性T淋巴细胞与免疫检查点封锁治疗结合后，肿瘤经21天的治疗即可消失。

图7 (A)在808 nm激光(0.5 W·cm-2)照射下，注射PLGA-ICG-R837、PLGA-ICG及PBS的荷瘤小鼠的光热图像；(B)肿瘤小鼠经治疗后，其继发肿瘤生长曲线[28]

3 总结与展望

ICG作为一种近红外荧光染料，已被广泛用于血管造影、肝胆手术切除等临床领域。近年来，由于其特殊的光学性质，ICG还在各类肿瘤的诊断与治疗方案中崭露头角。相当数量的研究表明，ICG既可指导肿瘤手术，还能抑制肿瘤细胞的生长。因此，相信在未来，将ICG骨架进行改造，有可能得到更具穿透性的近红外Ⅱ区荧光染料，进而满足日益增长的疾病诊断分辨率要求，此外，具有生物相容性的ICG还可被用于生物体内细菌，尤其是耐药细菌的诊疗，这将为提高人口健康水平做出更大的贡献。