N-取代苝酰亚胺小分子自组装形貌及生物学应用研究进展

李凯文，谈春霞

(甘肃省中药质量与标准研究重点实验室, 甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000)

具有π共轭体系的3,4,9,10-苝四羧酸二酰亚胺(perylene-3,4,9,10-tetracarboxylic imide，PDI)是结构很好修饰的荧光性染料分子，也是较好的n型有机半导体分子[1]。苝环结构中同时具有π共轭体系和吸电子性质的酰胺基团，因此整个体系具有电子给体-电子受体特征。

基于PDI结构的衍生物及其低聚物通常被报道可以在溶液中自组装成有序的超分子纳米结构，形成有序的超分子聚集体。关于一些小分子苝酰亚胺衍生物利用自组装的方式成功构筑功能纳米结构已被广泛报道[2]。研究表明，由于具有特定结构的PDI[3-4]在测试环境中容易产生聚集体，PDI衍生物分子通常会以纳米级超分子结构的形式存在于水溶液中(图1)。另外，还发现PDI探针在较低的浓度下具有细胞渗透性[5]，在细胞生物医学中具有潜在的应用。然而，在分子探针设计中，水溶性仍然被认为是一个具有挑战性的目标，这使得合成新型高度水溶性的有机探针具有重大的科学意义。本文从PDI自组装形貌、荧光性质及其生物学等方面对具有特殊结构的PDI小分子衍生物进行了选择性地总结和归纳。

图1 N-取代苝酰亚胺衍生物结构示意图Fig.1 Scheme of the structure of N-perylene imide derivatives

1 自组装形貌

苝酰亚胺及其衍生物作为典型的稠环芳香分子，分子之间存在较强π-π的相互作用。并且通过引入不同的官能团对苝酰亚胺分子结构进行修饰，就可以很好地协调各种非共价键作用力，包括氢键、π-π相互作用、配位键、亲水/疏水作用、静电作用力、范德华力等，获得结构和功能较好的超分子组装材料[6]。PDI官能化的衍生物在溶液中可以很容易地自组装成超分子纳米结构。在不同自组装条件下，聚集体形貌有所不同。自组装过程和聚集体的形貌与衍生物的侧链的结构、测试溶剂、溶液的pH等因素有关。

1.1 侧链因素

通过各种光谱技术收集的结果显示所考察的苝酰亚胺衍生物的侧链取代基对其结构形态和光学性质有影响。如图2所示，化合物1(DP-PDI)，结构中具有短的线性侧链取代基均表现出在有机溶剂(乙腈、己烷和甲醇)中聚集的趋势，并且由于疏水性而形成一维(1D)自组装(纳米线)，线性侧链之间的相互作用与苝酐平面之间的π-π相互作用高度协作。在化合物2(DT-PDI)，具有长的线性侧链取代基的情况下，观察到相似的聚集行为，并形成块状聚集体。与线性链取代基相反，化合物3(DH-PDI)(具有分支的侧链)则形成了零维(0D)自组装(纳米球),这是由于分支链的空间位阻而无法沿一个方向生长[7]。

图2 化合物1,2,3结构示意图及扫描电镜照片(a) DP-PDI自组装环境：化合物1的氯仿溶液注入到过量的乙醇溶剂中 (b) DT-PDI自组装环境：化合物2的氯仿溶液注入到过量的乙醇溶剂中(c) DH-PDI 自组装环境：化合物3的氯仿溶液注入到水/甲醇(体积比 35/65)混合溶液中 (d) DH-PDI放大倍数的图片Fig. 2 Scheme of compounds 1, 2, 3 and scanning electron micrographs (a) DP-PDI self-assembly: the chloroform solution of 1 was injected into an excess of ethanol solvent; (b) DT-PDI self-assembly: the chloroform solution of 2 was injected into the excess ethanol solvent; (c) DH-PDI self-assembly: the chloroform solution of 3 was injected into the mixed solution of water/methanol (v/v∶35/65) (d) the magnified image of DH-PDI

这样的聚集体的形貌与我们研究有机-多金属氧簇化合物的自组装形态有相似之处[8-10]：连有疏水基团的衍生物在溶液中自组装，疏水基团较短时分子之间较强π-π作用力，使得化合物在有机溶剂中自组装成具有一定长度的一维形貌；如果疏水基团相对较大，在疏水作用、范德华力作用下，化合物在混合溶剂中(含有水)容易形成具有纳米尺寸的球形形貌，同时体积较大的基团也妨碍了一维形貌的形成。

1.2 溶剂因素

N-取代苝酰亚胺衍射物在溶液中的自组装过程及形貌还受到溶剂的影响。在溶液中衍生物的自组装除了π-π相互作用力外还与氢键、亲水/疏水作用、静电作用力等这些重要的非共价键力有关。

早期的文献[11]报道了丁基取代的苝酰亚胺衍生物4。在氯仿/甲醇溶剂，由于母核的强π-π作用以及侧链的疏水作用，形成了结构清晰的一维纳米带状结构(图3)。

图3 丁基取代的苝酰亚胺4的纳米带状结构Fig.3 TEM image of nano ribbons for compound 4 with butyl-substituted peryleneimide

PDI衍生物5[12]是同时具有氨基和羧基结构的衍生物，在相对非极性的溶剂(THF和CHCl3)中由于π-π紧密堆积成形成较长的纤维的形态，而在极性更大的溶剂(六氟异丙醇、甲醇、乙腈和丙酮)中，形成了球形形貌，自组装过程和聚集体形貌都显示了出对溶剂极性的明显依赖性。由实验结果可以看出，在极性溶剂中，衍生物5中的氨基和羧基更容易与极性溶剂相互作用，在主要的疏水作用下能更有效地聚集，并且随着溶剂极性的增加，纳米结构的尺寸有显著增加。由于5结构中存在手性基团，在四氢呋喃溶剂中获得的长3～10 μm的右旋螺旋纤维，在相同的条件下的氯仿溶剂中却只观察到了没有螺旋的细(～2 μm)的纤维，除此之外的其它测试溶剂中，5只得到了纳米球状形貌(图4)。作者推测在四氢呋喃溶剂中5与溶剂间的氢键作用力形成了具有手性结构的形貌。

图4 化合物5(10 μmol/L)在不同溶剂中的扫描电镜图片Fig.4 SEM images of compound 5 (10 μmol/L) in different solvents

在苝环的海湾处进行取代基修饰的结构，使得分子自组装过程中依赖苝酐核π-π堆积变得困难。文献报道的碳酸烯丙酯官能化的苝二酰亚胺衍生物6[13]，可以很容易地在CH3CN中π-π相互作用，自组装成数十毫米长的纳米棒；在30% H2O、DMSO混合物中，氢键、亲水作用下自组装成长度为数十毫米的纳米线；而仅在乙酸乙酯中，由于疏水作用形成纳米球。实验结果表明：碳酸烯丙酯的引入增加了分子的水溶性，使6可以在含有水的混合溶剂中伸展形成纤维，而在有机溶剂中形成纳米球形貌(图5)。

图5 化合物6在不同溶剂中的自组装形貌Fig.5 Self-assembly morphology of compound 6 in different solvents

文献报道的结构中引入有两个二茂铁(Fc)单元的苝酰亚胺母核组成的电子供体-受体分子(D-A)7(PDI-Fc)[14]，是通过基于溶液的自组装制备的。在制备的过程中通过简单地调节分子的初始浓度来形成定义明确的PDI-Fc纳米棒，纳米线和微米线。图6显示了调节溶剂CH2Cl2中PDI-Fc的初始浓度可以得到不同大小和形态的PDI-Fc自组装形貌。

图6 不同初始浓度的PDI-Fc在CH2Cl2溶剂中的自组装扫描电镜图片： (a) 0.2 mM; (b) 1.0 mM; (c) 1.5 mMFig.6 SEM pictures of PDI-Fc Self-assembly in CH2Cl2 solvent with different initial concentrations (a) 0.2; (b) 1.0; (c) 1.5 mM

一种新型的两亲性苝酰亚胺衍生物8：七氟丁基取代的苝酰亚胺二聚体被报道。文献研究了该二聚体在不同体积比的四氢呋喃/水(THF-H2O)混合溶剂中的自组装性能[15]。该二聚体在75/25、50/50和25/75(THF/H2O，体积比)混合溶剂中分别自组装形成微米级的“花”状聚集体，微米级“蝴蝶结”聚集体和 “空心球”型纳米结构。数据显示混合溶剂系统中的水含量对两亲性的聚集微观结构(形态)的变化有很大影响。具有两亲性结构的N-取代苝酰亚胺衍生物在含水的混合溶剂中一般不会得到一维形态，自组装过程中受到亲水/疏水作用力、范德华力等因素的影响形成三维形貌的聚集体，符合两亲性化合物在溶液中的聚集特征[16]。如果在苝酰亚胺母核上引入具有手性结构的基团，自组装形貌还会具有手性特征。

图7 化合物8在THF/H2O不同比例(体积比)的混合溶剂中的自组装扫描电镜图片：(a) 75/25 (b) 50/50 (c) 25/75Fig.7 SEM images of compound 8 self-assembly in mixed solvents with different ratios of THF/H2O (a) 75/25 (b) 50/50 (c) 25/75

1.3 手性因素

基于糖基设计的两亲性苝酰亚胺衍生物9[14]，能够和溶剂以氢键相互作用。苝环一端是亲脂性的烷基链，另外一端是具有手性的亲水性的多羟基集团。在极性-非极性混合溶剂(氯仿/正辛烷)中，从纯氯仿溶剂到混合溶剂体积比为50/50变化中，形成了旋光性左旋螺旋聚集体。在溶解性好/溶解性差的溶剂中该化合物展现了相反的手性聚集行为。从纯四氢呋喃溶剂到混合溶剂(四氢呋喃/水)体积比为20/80，形成旋光性右旋螺旋聚集体。透射电镜的结果和圆二色光谱测试结果相吻合(图8)。

图8 化合物9手性螺旋纳米线的透射电镜照片，测试溶剂为：(a) 氯仿/正辛烷 (80/20, 体积比)； (b) 四氢呋喃/水 (80/20, 体积比)；(c) 氯仿/正辛烷(50/50, 体积比)；(d) 四氢呋喃/水(50/50, 体积比)Fig.8 TEM images of compound 9 with chiral spiral nanowire obtained in the test solvent (a) chloroform/n-octane (80/20, v/v); (b) Tetrahydrofuran/water (80/20, v/v); (c) chloroform/n-octane (50/50, v/v); (d) Tetrahydrofuran/water (50/50, v/v)

利用分子间非极性共价键相互作用设计的手性不对称苝酰亚胺衍生物10[15]，一端为非极性的C12烷基链，另一端连接3,5-二甲氧基苄基作为手性极性侧链。透射电镜实时监测了早期自组装聚集体的形成。由(S)-构型的10在氯仿/乙醇混合溶剂自组装形成左旋纳米管，(R)-构型的10在乙腈纯溶剂中的自组装聚集形成右旋纳米管，这样的单手性纳米管具有较高的荧光量子产率(> 46%)。实验得出结论：利用在分子结构中引入手性集团可以得到具有单一手性的自组装聚集体。

1.4 pH因素

苝酰亚胺的N端连接两个臂状离子化的氨基咪唑基团是新型的衍生物11[16]，其结构中的咪唑集团改善了苝酐类衍生物在水中的溶解度，同时也保留了苝环母核在溶液中的超分子自组装的能力。在pH调节循环中，衍生物11水溶液在低pH(4.0)没有出现聚集，溶液澄清透明，而在高pH(8.0)时产生了聚集体。透射电镜图显示在pH 4.0下只观察到短的纳米带，在pH 8.0下观察到长的杂交的纳米带。通过调节溶液的pH(从pH 4.0到pH 8.0)，短纳米带可以自组装形成长的支链纳米带。文献报道这个分子自组装过程是可逆的，通过调节溶液的pH(从pH 8.0到pH 4.0)长的杂支纳米带又可以分解成短的纳米带(图10)。 不同pH的测试环境中，亲水/疏水作用、静电作用力、范德华力等形成自组装聚集体的主要因素不同，出现了在pH调节循环中可逆的聚集过程现象。

图9 化合物10的结构示意图(左图) (a) (S)-构型CD图；(b)(R)-构型CD图, 测试浓度：0.1 mmol/L,测试溶剂：氯仿/乙醇(c)(S)-构型透射电镜图(d)(R)-构型透射电镜图Fig.9 Scheme of compound 10 (left); right: (a) (S)-CD spectra (b) (R) -CD spectra, measured in a mixed solvent of 0.1 mL of chloroform/ethanol mixed solvent (c) TEM image of nanotubes of (S)-10 (d) TEM image of the and (R)-10

图10 化合物11的结构示意图以及在不同pH环境中的自组装形貌Fig.10 Scheme of compound 11 and its self-assembly morphology in different pH environments

两种全甲基化的环糊精连接在苝酰亚胺母核氮原子上形成了新的水溶性衍生物12[17]。该衍生物在水溶液中具有很强的π-π聚集特点，显示出pH依赖的聚集行为和荧光性质(图11)。12在碱性环境下的结构为中性形式的12-1，相对于有机溶剂其在水中的更强π-π堆积作用。酸性环境下质子化形式的12-1H2，因为质子化亚氨基之间的静电排斥作用在苝酰亚胺母核的π-π堆叠中起到不利的作用，分子呈现单体和少量的低聚物存在形式。尽管如此，单体和12-1H2的低聚物显示出荧光性能优于中性形式，这是由于有效抑制了亚氨基的分子内电子转移过程所造成的。

图11 化合物12在不同pH环境下的结构示意图(左图) (a)，(b)均为12中性形式的透射电镜和扫描电镜照片 (c) 12质子化形式的透射电镜照片 (d) 12的pH依赖的聚集行为和荧光性质示意图，以上测试环境为水溶液Fig.11 Scheme of compound 12 in different pH environments (left); (a) and (b) are TEM and SEM pictures of compound 12 with the neutral form; (c) TEM pictures of compound 12 with the protonated form; (d) A schematic diagram of the pH-dependent aggregation behavior and fluorescence properties of 12, all measured in aqueous solution

2 N-取代苝酰亚胺衍生物的荧光性质在生物学方面的应用

苝酰亚胺被认为是一个封闭的发色团，存在S0→S1的跃迁，荧光量子产率几乎是定量的，且产率与寿命也不受氧的影响。人们在N端进行着各种尝试，引入对物质有识别作用的基团，利用苝类衍生物具有的荧光性质[18]产生具有特定结构的金属离子识别探针、荧光分子开关等[19-21]。PDI衍生物特有的荧光性质可以应用于细胞荧光成像、荧光标记和荧光载体等生物学检测方面[22]。然而由于苝核在溶液中的堆积作用，溶液中形成分子聚集体的同时常常伴随着荧光淬灭。有学者研究表明: 苝酰亚胺的荧光发射峰与取代基的位置有关[23]。 在酰亚胺结构中的N原子上引入不同的取代基，并不会影响苝酰亚胺的紫外吸收和荧光发射峰的位置，但是可能会影响到该类衍生物的荧光量子产率。

文献报道由单甘露糖修饰的含有双甲基取代的环糊精结构的苝酰亚胺衍生物13[24]表现出有效的光动力治疗活性[25](图12)。研究了其对人乳腺癌细胞(MCF-7)，宫颈癌细胞(Hela)，肺癌细胞(A549)和肝癌细胞(HepG2)细胞的光动力疗法活性。化合物表现出强大的光动力疗法活性，其半数最大抑制浓度(IC50)分别为3.96、16.79、6.62和5.14 mmol/L，作为一种新型PDI分子表现出很高的光细胞毒性和活细胞成像应用。

图12 化合物13的结构示意图以及细胞成像Fig.12 Scheme of compound 13 and cell imaging

用烷氧基硅烷基团改性的两种苝酰亚胺衍生物14和15与二氧化硅形成的纳米粒子[26]，可有效地内化到HEK293细胞中，且毒性低，并且具有很高的光稳定性，在表达高水平荧光蛋白和/或与不同荧光染料共染的细胞中，两种蛋白通常在光谱的可见光区域内发射(图13)。

图13 烷氧基硅烷基团改性的两种苝酰亚胺衍生物14、15结构示意图Fig.13 Scheme of t two perylene imide derivatives 14, 15 modified by alkoxysilane groups

水溶性的苝酰亚胺阳离子有很强的单体荧光性，如果在水溶液中自组装聚集后，则荧光强度显著下降(图14)。文章中作者以含有苝酰亚胺骨架的季铵盐16构建了PDI-DNA络合物[27]，通过DAN链断裂检测博来霉素(BLM)的方法。PDI基团对荧光团修饰的DNA片段具有较高的荧光淬灭效率，该方法显示了低背景荧光和高灵敏度，BLM检出限为0.2 nmol/L。

图14 PDI-DNA络合物通过DNA链断裂检测BLM的示意图Fig.14 Scheme of PDI-DNA complex detecting BLM by DNA strand breaks

在苝核的“海湾”位置引入取代基，可以减少苝核在溶液中的进一步堆积，引起紫外吸收峰和荧光发射峰位置的红移，因此能有效避开细胞的荧光背景，进而提高其在生物学检测方面的应用。近几年，合成的基于苝酰亚胺核的树状大分子结构中，由内向外引入疏水基团，最外层为亲水基团。这些衍生物显示出强烈的红色荧光，具有较高的水溶性、较好的光稳定性、较低的细胞毒性和高的荧光量子产率。这部分在“海湾”位置改造苝酰亚胺和的树状苝核分子化合物的荧光性质及其应用将另外撰文讨论。

3 结论及展望

文章介绍了基于苝酰亚胺骨架，通过共价键形成的具有特殊结构的衍生物。聚集体在溶液中通过非共价键作用力形成了各种超分子组装材料。调控衍生物分子结构中侧链或手性基团可以得到具有特定形貌的聚集结构，在有机溶剂、混合溶剂、水溶液中还需要充分考虑到溶剂和pH环境的影响。通过协调好这几种作用力和因素从而获得结构致密、功能优良的超分子材料。各种连接在苝酰亚胺发色团骨架上的衍生物可以调节母核的荧光性质，进而获得多功能的荧光材料。水溶性的苝酰亚胺衍生物改变了该类染料难溶于水的缺陷，能够将母核特有的荧光性质用于生物学性质测试。综上所述，基于苝酰亚胺结构，通过修饰母核上连接的取代基的结构或是设计连接特定基团，可以增强其生物兼容性基团，得到更多的结构丰富、性能优越的纳米分子材料，将其特有的荧光性质应用于生物体检测和成像、以及药物载体等方面。但是，仍然存在一些问题，例如水溶液中PDI的荧光量子产率低，未来将探索更简单，更具选择性和更具体的合成策略。 最终树状聚合物的无毒和多功能化仍是生物应用中的挑战。 如何在各个领域应用荧光性能并探索以PDI为核心的树枝状聚合物的巨大潜力，将成为未来的热门研究领域。