指纹图谱及多成分定量结合化学模式识别法评价不同产地消瘤藤质量

黄建猷 ，胡筱希，麦琬婷，黄周锋 ，章 波，陆国寿 *，叶 勇*

1.广西壮族自治区中医药研究院，广西 南宁 530022

2.广西中药质量标准研究重点实验室，广西 南宁 530022

3.广西医科大学药学院，广西 南宁 530021

消瘤藤是虎耳草科冠盖藤属植物星毛冠盖藤Pileostegia tomentellaHand.-Mazz的藤茎，主要分布于浙江、江西、福建、湖南、广东、广西、贵州等地[1]。广西民间瑶医多年的临床实践证明，消瘤藤具有抗肿瘤作用，可用于治疗多种恶性肿瘤；同时也是广西金秀瑶族自治县瑶医医院肿瘤科用于治疗各种肿瘤的主药[2-3]，消瘤藤主要含有香豆素类、环烯醚萜苷类和苯丙素类等化学成分[3-6]，具有祛风除湿、散瘀止痛、消肿解毒的功效，现代药理研究显示，其不同提取部位及总香豆素等具有抗肿瘤作用[7-10]。目前已有文献报道消瘤藤药材质量研究，但依然存在质量控制指标简单等问题，无法系统地评价不同产地消瘤藤药材质量的差异性[11-12]。鉴于此，本研究首先建立了消瘤藤药材的HPLC指纹图谱，并以多波长同时测定其中茵芋苷、7-羟基香豆素、紫丁香苷、7-羟基-8-甲氧基香豆素和当药苷的含量，通过SPSS 22.0统计软件和Origin Pro软件对其进行主成分分析及聚类分析，对不同产地消瘤藤药材质量进行综合评价，为评价该药材质量提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters高效液相色谱仪（2998 PDA Detector，Waters e2695 Separations Module，Empower 3色谱工作站，美国Waters公司）；XS-205型电子天平（瑞士梅特勒公司）；KS-3200DE液晶超声波清洗器（昆山洁力美超声仪器有限公司）。

1.2 试药

7-羟基-8-甲氧基香豆素（上海源叶生物科技有限公司，批号X14O10L100104，质量分数≥98.5%）；茵芋苷（四川省维克奇生物科技有限公司，批号wkq19011409，质量分数≥98%）；7-羟基香豆素（上海源叶生物科技有限公司，批号A04A6L1，质量分数≥98%）；当药苷（中国食品药品检定研究院，批号111742-200501，质量分数≥98%）；紫丁香苷（中国食品药品检定研究院，批号111574-201605，质量分数≥98%）。磷酸（广东光华科技股份有限公司，分析纯），乙醇（广东光华科技股份有限公司，分析纯），乙腈（默克股份两合公司，色谱纯），Milli-Q超纯水系统（美国Milipore公司）。

1.3 药材

消瘤藤分别采集于广西不同地点，具体见表1。经广西中医药研究院黄云峰副研究员鉴定为冠盖藤属植物星毛冠盖藤P.tomentellaHand.- Mazz.的藤茎。

表1 消瘤藤药材信息Table 1 Information table of 14 batches of Pileostegia tomentella Hand.

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

取消瘤藤粉末（过40目筛）约0.5 g，精密称定。置具塞三角瓶中，精密加入80%乙醇25 mL，称定质量，超声处理60 min，放至室温，用80%乙醇补足减失的质量、摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2 混合对照品溶液的制备

取茵芋苷、7-羟基香豆素、紫丁香苷、7-羟基-8-甲氧基香豆素和当药苷对照品，精密称定，加甲醇制成茵芋苷、7-羟基香豆素、紫丁香苷、7-羟基-8-甲氧基香豆素和当药苷质量浓度分别为234.80、68.48、3.27、24.31、38.17 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱为Waters XBridge®C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.1%磷酸（A）-乙腈（B）；梯度洗脱：0～45 min，95%～60% A；45～46 min，60%～95% A；46～60 min，95% A；体积流量1 mL/min；柱温25 ℃；检测波长265 nm；进样体积10 μL。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同一批消瘤藤粉末（S1）约0.5 g，精密称定，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，以6号峰（茵芋苷）为参照峰计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果显示各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值均小于2%。

2.4.2 稳定性试验 取同一批消瘤藤粉末（S1）约0.5 g，精密称定，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h测定，记录色谱图，以6号峰（茵芋苷）为参照峰计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值均小于3%，表明供试品溶液在室温放置24 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 取同一批消瘤藤粉末（S1）约0.5 g，精密称定，一式6份，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，以6号峰（茵芋苷）为参照峰计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值均小于3%，表明该方法重复性良好。

2.5 指纹图谱的建立

2.5.1 共有峰的标定 取14批不同产地消瘤藤粉末，分别按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定，获取14批消瘤藤指纹图谱。将14批不同样品的色谱图导入由国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”，以S1为参照指纹图谱，采用多点校正后进行自动匹配，选择中位数法生成对照指纹图谱，选择消瘤藤中的主要成分且分离较好的色谱峰作为共有峰。

经“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”得到14批消瘤藤指纹图谱（图1）和对照指纹图谱（图2），且共标定了12个共有峰，12个共有峰总面积占总峰面积的90%以上，因此确定12个色谱峰为消瘤藤指纹图谱的共有峰。

图1 14批消瘤藤HPLC指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints of 14 batches of Pileostegia tomentella

图2 消瘤藤对照指纹图谱Fig.2 Comparison fingerprint of Pileostegia tomentella

2.5.2 相似度 将得到的14批消瘤藤指纹图谱导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”，进行色谱峰匹配，生成消瘤藤对照指纹图谱，并计算不同批次之间的相似度。14批样品与对照图谱之间的相似度分别为0.944、0.937、0.965、0.899、0.959、0.965、0.965、0.942、0.967、0.901、0.875、0.975、0.905、0.955。除全州龙水镇、藤县2个产地的药材外，其余产地的消瘤藤药材相似度均大于0.9，说明这些产地消瘤藤药材质量差异较小；而全州县龙水镇和广西藤县的消瘤藤药材相似度均接近0.9，说明这2个产地的消瘤藤虽然具有一定相似性，但质量差异较大。

2.5.3 主要色谱峰的化学指认 采用对照品对各峰进行指认，按“2.3”项下色谱条件进样分析，记录HPLC色谱图，通过比较各峰保留时间和紫外吸收光谱，对各峰进行指认。消瘤藤样品HPLC指纹图谱中茵芋苷（6号峰）、紫丁香苷（7号峰）、当药苷（10号峰）、7-羟基香豆素（11号峰）、7-羟基-8-甲氧基香豆素（12号峰）得到了化学指认。

2.6 HPLC同时测定消瘤藤中5种有效成分的含量

2.6.1 色谱条件 色谱柱为Waters XBridge®C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.1%磷酸（A）-乙腈（B）；梯度洗脱：0～50 min，95%～70% A；体积流量1 mL/min；柱温25 ℃；检测波长246、265、320 nm；进样体积10 μL。茵芋苷、7-羟基香豆素、紫丁香苷、7-羟基-8-甲氧基香豆素和当药苷5个成分按此色谱条件进行分析，理论塔板数均不低于3000，分离度均大于1.5，各成分测定不受它成分干扰。对照品和供试品的色谱图见图3。

图3 混合对照品溶液 (A) 和消瘤藤供试品溶液 (B) HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of mixed reference solution (A) and pileostegia tomentella test solution (B)

2.6.2 线性关系考察 精密吸取“2.2”项下的混合对照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，分别置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，得系列混合对照品溶液。按“2.3”项下的色谱条件下分别进样，记录峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），进样质量为横坐标（X），进行线性回归，即得回归方程及线性范围。回归方程、线性范围及相关系数分别为：茵芋苷Y=2 019 280.3X－8 147.4，线性范围0.234 8～2.348 0 μg，r=0.999 8；紫丁香苷Y=2 928 157.5X－491.2，线性范围0.00 327～0.03 27 μg，r=0.999 6；当药苷Y=2 189 650.3X－6 371.9，线性范围0.038 17～0.381 7 μg，r=0.999 7；7-羟基香豆素Y=4 140 844.6X－6 992.5，线性范围0.068 48～0.684 8 μg，r=0.999 8；7-羟基-8-甲氧基香豆素Y=4 979 120.6X－2 767.7，线性范围0.024 31～0.243 1 μg，r=0.999 9；结果表明5种成分在上述质量范围内线性关系良好。

2.6.3 精密度试验 取同一混合对照品溶液在“2.6.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱峰面积。茵芋苷、紫丁香苷、当药苷、7-羟基香豆素和7-羟基-8-甲氧基香豆素峰面积的RSD分别为0.48%、0.83%、0.68%、0.29%和0.52%，表明仪器精密度良好。

2.6.4 稳定性试验 取消瘤藤药材（S1）粉末1份，约0.5 g，精密称定，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，室温下放置，分别在0、2、4、8、12、24 h后按“2.6.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱峰面积。茵芋苷、紫丁香苷、当药苷、7-羟基香豆素和7-羟基-8-甲氧基香豆素峰面积的RSD分别为0.80%、1.35%、1.03%、0.87%和0.96%，表明供试品溶液放置24 h内稳定性良好。

2.6.5 重复性试验 取同一批消瘤藤药材（S1）粉末6份，每份约0.5 g，精密称定，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.6.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱峰面积。茵芋苷、紫丁香苷、当药苷、7-羟基香豆素和7-羟基-8-甲氧基香豆素质量分数的RSD分别为1.48%、2.01%、1.97%、1.88%和1.39%，表明该方法重复性良好。

2.6.6 加样回收率试验 取同一批消瘤藤药材（S1）粉末6份，每份0.25 g，精密称定，加入混合对照品适量，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.6.1”项下色谱条件测定，记录色谱峰面积，计算回收率。茵芋苷、紫丁香苷、当药苷、7-羟基香豆素和7-羟基-8-甲氧基香豆素的平均加样回收率分别为99.85%、97.62%、98.98%、98.87%和99.01%，RSD值分别为1.77%、2.63%、2.57%、2.55%和2.38%。

2.6.7 样品测定 取不同产地消瘤藤药材粉末，按“2.1”项下方法平行制备供试品溶液各2份，按“2.6.1”项下色谱条件测定，记录色谱峰面积，计算样品中茵芋苷、紫丁香苷、当药苷、7-羟基香豆素和7-羟基-8-甲氧基香豆素5个成分的量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果 (n＝2)Table 2 Results of contents determination of samples (n＝2)

2.7 化学模式识别

2.7.1 聚类分析 采用Origin Pro软件通过平均聚类方法对14批药材样品采用分层聚类分析。这14批药材可以分为3类，第1类为S1、S2；第2类为S7、S10、S12、S14；第3类为S3、S4、S8、S9、S2、S5、S6、S11、S13。聚类图见图4。

图4 聚类热图Fig.4 Cluster analysis tree diagram

2.7.2 主成分分析 为了进一步比较不同产地批次间消瘤藤样品的质量差异，将消瘤藤中的茵芋苷、紫丁香苷、当药苷、7-羟基香豆素和7-羟基-8-甲氧基香豆素5个成分的含量作为变量导入到SPSS 22.0统计软件中进行主成分分析。选取其中特征值大于1的前2个因子作为主成分1（PC1）与主成分2（PC2），贡献率分别为62.692%和21.441%，对总方差的累积贡献率达84.136%（表3），故PC1和PC2 2个主成分可反映消瘤藤药材的整体综合质量。

表3 特征值和累积贡献率Table 3 Eigenvalue and cumulative contribution

由表4因子载荷矩阵可知，PC1与茵芋苷、紫丁香苷、当药苷、7-羟基香豆素和7-羟基-8-甲氧基香豆素5个成分均呈正相关；PC2与紫丁香苷和7-羟基-8-甲氧基香豆素呈正相关。根据公式F＝Zx×t计算各主成分值，其中Zx原始数据标准化得标准化矩阵，t为标准化的正交特征向量矩阵。根据各主成分的贡献率，计算出综合得分，其公式为F＝0.626 95×F1＋0.214 41×F2，分别以PC1与PC2建立坐标系，得到主成分分析散点平图（图5），各主成分值及综合排序结果见表5。

表4 因子载荷矩阵Table 4 Load matrix of factors

表5 主成分值及综合主成分值Table 5 Principal component values and comprehensive principal component values

由图5可看出，PC1和PC2可将样品分为3类，第1类为S1、S2；第2类为S7、S10、S12、S14；第3类为S3、S4、S8、S9、S2、S5、S6、S11、S13。主成分分析与聚类分析结果相一致，进一步证明了PC1和PC2可代表消瘤藤的质量用于产地划分。主成分分析得到的综合主成分值，根据得分情况反映各产地消瘤藤的质量情况，质量越好，综合得分越高。本研究中S12、S1、S14质量相对较优。

图5 主成分分析散点图Fig.5 Scatter plots of principal component analysis

4 讨论

消瘤藤是传统瑶医药治疗癌症的主要药材之一，已被列入《广西壮族自治区瑶药材质量标准（第二卷）》拟收录品种。由于地区的差异，可能导致消瘤藤品质上的不同，进而可能影响其药效。本研究通过对广西不同产地的14批消瘤藤药材进行指纹图谱研究，结果发现14批次间样品相似度较好，质量相对较稳定。后续又测定了茵芋苷、紫丁香苷、当药苷、7-羟基香豆素和7-羟基-8-甲氧基香豆素5种有效成分的含量，结果发现不同产地间含量存在较大差异。通过聚类分析和主成分分析等化学模式识别法[13-14]对其进行全面综合的质量评价，结果表明S1、S12、S14等产地的消瘤藤质量较好。

文献报道[15]，香豆素类化合物具有抗病毒、抗肿瘤、抗心律失常、抗炎镇痛及抗菌等多种药理活性，具有潜在的药用价值，其中抗肿瘤作用是一个研究热点；环烯醚萜类化合物在抗肿瘤、抗炎、降血糖、保肝活性等方面受到学者广泛关注[16]；紫丁香苷具有具有一定的体内外抗肿瘤活性[17]。结合主成分分析综合得分及5个成分含量测定结果可知，综合得分排在前3的S1、S12、S14其5个成分的含量也非常靠前，综合得分排在倒数前3的S9、S6、S5其5个成分的含量也非常靠后。综合得分与5个成分的含量是怎样一个关系，还有待进一步的研究。

中药质量控制研究一直是中药研究与发展的关键[18]，在中药现代化的研究进程中，指纹图谱技术是当今国际公认的控制中药质量的质控模式。本研究建立指纹图谱与含量测定相结合，应用化学模式识别法可全面评价消瘤藤质量。该法的建立为消瘤藤的质量控制及评价提供依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突