TPM4蛋白在结直肠癌及癌旁组织中的差异表达

赵月鸣，韩秀娟，邢德君

(吉林省肿瘤医院内三科，吉林 长春 130012)

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是当代常见消化道恶性肿瘤之一。在我国，结直肠癌的发病率居常见肿瘤的第四位[1-4]，仅次于肺癌、胃癌及肝癌。由于结直肠癌发生机制尚不完全明确，故在结直肠癌的诊治方面仍存在困难，发病率、死亡率居高不下。目前，手术治疗是结直肠癌最有效的治疗方法，非手术治疗的方法主要有化疗、放疗、生物治疗及分子靶向治疗。在我国，由于大部分患者被确诊时已属中晚期，术后超过1/3的患者出现复发转移，严重影响患者的生活质量、缩短生存期。因此高效筛查、早期诊断和复发的早期检测是提高结直肠癌的疗效和预后的关键。原肌球蛋白(TPM)是细肌丝中与肌动蛋白的结合蛋白，是一种调节蛋白，它在肌肉收缩过程中起着很重要的作用，哺乳动物中的4个TPM基因已被确认，即TPM1、TPM2、TPM3、TPM4。目前对TPM4的研究较少，主要集中在肿瘤[5-6]、与肌肉相关疾病[7-9]。肿瘤方面主要局限在与乳腺癌转移的相关性研究及膀胱癌的相关性研究。本文通过以结直肠腺癌组织、癌旁组织为研究对象，进行双向电泳和质谱分析，筛选结肠腺癌及癌旁组织之间差异蛋白。对TPM4蛋白进行Western印迹试验，提示TPM4蛋白可能为结直肠癌的诊断和指导治疗以及判断预后提供了一个新的靶点。

1 资料与方法

1.1一般资料：本试验需使用新鲜的结直肠癌组织及癌旁正常组织，癌旁正常组织取材需位于癌组织上端，且距离肿瘤边缘≥5 cm，经术后病理证实为阴性。结直肠癌标本经术后病理确诊断为腺癌，TNM分期Ⅲ期，术前均未接受任何治疗。依据上述筛选标准，我院自2018年1月～2019年12月之间收集组织标本23例，每例均包括癌组织及配对的癌旁正常组织。手术时即时取材，清洗干净，离体后30 min内放入液氮速冻，然后放入-80℃冰箱保存。

1.1.2试剂:固相pH梯度干胶条 (pH3～10.17 cm；pH5 ～8.17 cm)、碘代乙酰胺(IAM)、蛋白质定量试剂盒购自美国Bio-Rad公司，尿素、硫脲、碳酸氢钠、苯甲基磺酰氟、三羟甲基氨基甲烷、二硫苏糖醇、3-[(3 -胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸、DNA酶、山羊抗鼠IgG、丙烯酰胺、考马斯亮蓝购自美国Sigma 公司，RNA酶、TPCK修饰的测序级胰酶购于美国Promega公司，蛋白抽提试剂盒购自CWBio公司，TPM4鼠抗人单抗购自英国Abcam公司，脱脂奶粉购自内蒙古伊利集团。

1.2实验方法

1.2.1样品总蛋白提取及蛋白浓度测定:从-80℃冰箱中取出少量组织标本，在低温PBS中将肉眼可见的血洗去，用无菌剪刀将样本剪碎，在液氮中将样本研磨成匀浆。分别称量已研成匀浆的结直肠癌组织及癌旁正常组织各50 mg，分别加入200 μl组织蛋白抽提试剂，放在冰上20 min。4℃，12 000 r/min离心60 min。考马斯亮蓝法(Bradford法)测定上清液中的蛋白质浓度：在595 nm处比色，以标准蛋白含量为横坐标，A595 nm为纵坐标，为纵坐标绘制标准曲线，测定样品中蛋白质含量。分装样本，置于-80℃冰箱中保存备用。

1.2.2样品蛋白水解多肽混合物的制备:将冻存的总蛋白样品放在室温条件下，至其完全融化。加入3～5倍体积的50 mmol/L碳酸氢氨将总蛋白样品完全溶解。加入1 mol/L的二硫苏糖醇(DTT)以还原蛋白质中的二硫键，将其调定至终浓度为20 mmol/L；置于56℃，避光1 h；取出后待其温度降至室温，加入等量的1M的碘代乙酰胺(IAM)以防止打开的二硫键再结合，混匀后调定至终浓度为50 mM；避光30 min；按蛋白：胰酶以50∶1的比例向反应体系中加入测序级胰酶进行酶切，置于37℃水浴，过夜；酶切产物并真空抽干，置于-80℃冰箱中保存。

1.2.3二维色谱与质谱联用分离并鉴定多肽混合物:用0.1%FA缓冲液溶解样品，取50 μg上样，经反相色谱洗脱的多肽用 LTQXL离子肼质谱仪检测，质谱数据采用Bioworks 3.3.1 SP1软件，数据库检索用SEQUEST法进行以鉴定出相关多肽和蛋白质。用SEQUEST进行数据库检索，以鉴定出相关多肽和蛋白质。

1.2.4Western印迹试验:采用Western印迹试验对选定的目标蛋白-TPM4的表达情况进行进一步的验证。BCA法定量蛋白，使每个加样孔中蛋白量相同。内参照为β-actin。

2 结果

2.1癌组织总蛋白酶解混合物的二维色谱与质谱联用分析:应用二维液相色谱与质谱联用技术对结直肠癌组织总蛋白用酶解后所得产物进行分析，将全部多肽数据进行整理，共鉴定出了846个蛋白质。

2.2癌旁组织总蛋白酶解混合物的二维色谱与质谱联用分析:应用二维液相色谱与质谱联用技术对癌旁组织总蛋白酶解产物进行分析，将全部多肽数据进行整理，共鉴定出了535蛋白质。

2.3结直肠癌组织与癌旁组织差异蛋白的鉴定:通过肿瘤组织与癌旁组织中蛋白质的丰度变化来界定差异表达的蛋白质，每个蛋白的丰度通过谱图数来评价。笔者对差异蛋白的谱图数变化界定标准如下：①肿瘤组织与癌旁组织中蛋白谱图数的比值≥1；②肿瘤组织与癌旁组织中蛋白谱图数的差值≥72。

笔者根据上述标准，对比肿瘤组织与癌旁组织的蛋白分析数据，共鉴定出了有显著差异的蛋白共24个，其中在肿瘤组织中9个蛋白下调表达，15个蛋白上调表达。TPM4蛋白的串联质谱图见图1～5。

图1 TPM-4蛋白的质谱鉴定：IQLVEEELDRAQER序列肽段的串联质谱图

2.4TPM4的Western印迹结果:见图6。

图2 TPM4蛋白中KIQALOOOQDEAEDRAQGLQR序列肽段的串联质谱图

图3 TPM4蛋白中KLVILEGELER序列肽段的串联质谱图

图4 TPM4蛋白中KLVILEGELERAEER序列肽段的串联质谱图

图5 TPM4蛋白中RIQLVEEELDRAQER序列肽段的串联质谱图

图6 TPM4的免疫

3 讨论

直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一。在我国，结直肠癌的发病率和死亡率逐年上升，目前居于第4位，仅次于肺癌、胃癌及肝癌[10-11]。在结直肠癌的发病早期，患者一般无明显症状，且该病早期的诊断率较低，进展较快，当发展到中期、后期，患者才能有明显或者不明显的病变特征，丧失了治疗的最佳时期，缩短了生存期。因此高效筛查、早期诊断和复发的早期检测是提高结直肠癌的疗效和预后的关键。

如何探寻理想的肿瘤标志物，目前最常应用的是蛋白质组学技术，其检测肿瘤标志物的效率较高，且省时省力。本研究采用了二维色谱与质谱联用的方法研究了TNMⅢ期结直肠癌组织与癌旁组织之间蛋白表达谱的差异。从结直肠癌组织及癌旁组织差异蛋白水平上探讨差异蛋白与肿瘤发生、发展的相关性，从而有助于医务人员了解结直肠癌发生的机制，寻找早期诊断的新靶点，并为后续的工作奠定基础。 结果发现有24个差异蛋白，其中在结直肠癌组织中有15个蛋白上调表达，有9个蛋白下调表达。这个结果与本实验室前期所做的试验结果[12]相一致，但同其他的一些文献报道有所不同，分析原因可能有以下几种可能：①结直肠癌本身就是一种异质性的疾病，每位患者的病例特征均不同，故收集标本的标准不同、选取的标本类型不同、患者自身的因素都可能导致筛选结果的差异；②研究中所应用的方法及实验手法、试剂、仪器及其他一些干扰因素均存在差异，也会得出不同的结果；③蛋白质组学研究本身所包含的信息量就非常大，研究者们所得出的实验结果不同是正常的。但不可否认的一点就是，不同的研究者得到的都只是众多数据中的一部分，还有大量的结直肠癌的蛋白组学信息有待进一步发掘和研究。笔者详细检索文献后发现，实验中发现的差异蛋白一部分已经得到了验证[1-3]。本课题组从剩余的差异蛋白中选出TPM4蛋白作为研究蛋白，主要是因为TPM4有一定的生物学功能，在结直癌中没有报道，而且在生物制品公司可以买到TPM4的一抗。通过Western blot 蛋白质印迹实验检测上调蛋白TPM4在结直肠癌组织中的表达，结果可见TPM4蛋白在结直肠癌组织中表达明显高于配对的癌旁组织，进一步证实了，TPM4在结直肠癌组织中上周表达。