黄酮类化合物提取、分离纯化方法研究现状及展望

徐赫，李荣华，夏岩石，杨新泉

(广州大学 生命科学学院，广东 广州 510006)

黄酮类化合物是植物次生代谢中的一种重要产物，广泛分布于植物体的各个部位。其结构特征为含有两个或多个芳香环，且每个芳香环至少含有一个芳香羟基，并与一个杂环吡喃相连。根据分子结构可将黄酮类化合物分为以下几类：黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、二氢黄酮醇类、异黄酮类、二氢异黄酮类、查尔酮类、橙酮类及花色素类等。研究发现，植物黄酮如芦丁、槲皮素、水仙苷、异鼠李素及烟花苷等具有抗氧化和清除自由基的能力[1]，部分植物黄酮如懈皮素、染料木素、芦丁及柚皮苷等多种黄酮类物质具有优异的抗肿瘤能力[2]，一些植物黄酮对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和灰葡萄孢菌等有显著的抑制效果[3]。如何高效、安全地提取和纯化黄酮类化合物是当今黄酮类物质广泛研究的基础，黄酮类化合物因结构以及存在部位的不同，提取及纯化方式也有所不同。本文综述了黄酮类化合物提取、纯化方法的研究现状及特点，并对黄酮类化合物分离提取的前景进行了展望。

1 黄酮类化合物的提取方法

近年来用来提取黄酮类化合物的主要方法有：有机溶剂提取法、微波提取法、超声提取法、半仿生提取法、酶提法、蒸汽爆破法、超临界CO2萃取法和亚临界流体萃取法等,见表1。

表1 黄酮类化合物提取方法比较Table 1 Comparison of extraction methods of flavonoids

1.1 有机溶剂提取法

近年来提取黄酮类化合物多数采用有机溶剂提取，其原理是利用黄酮类物质易溶于有机溶剂的特点，采用浸提、回流提取及索氏提取法等提取方法将黄酮类物质从植物组织内部溶解出来。一般认为有机溶剂浓度越高越有利于提取效果，但是也不宜过高，因为植物中还存在大量的醇溶性杂质，浓度过高易使杂质溶解度增加，对结果形成干扰[4]。有机溶剂提取法中常用于植物黄酮提取的溶剂是乙醇、甲醇和丙酮，在其他条件相同情况下，使用丙酮溶液提取的总黄酮得率略高于乙醇，甲醇相对较低，考虑到乙醇相对成本低且毒性小等特点，选乙醇作为提取剂为更佳[5]。尽管有机溶剂提取法操作简单、成本低，但所需提取时间相对较长，效率低且提取物活性损失较大，不适用于工业大规模提取[6]。

1.2 微波辅助提取法

微波辅助提取植物黄酮的机理是微波产生的高频电磁波穿透有机溶剂，使植物细胞破裂，细胞内黄酮类物质可自由流出，更易于将黄酮类物质从植物组织内部溶解出来；同时微波产生的磁场还可加速黄酮类物质的溶解，使植物黄酮可以更快捷简便的被分离提取[7]。张艳等[8]在紫苏油粕总黄酮提取研究中，对比了微波辅助法及传统有机溶剂提取法对总黄酮得率的影响，发现微波辅助法的提取率较有机溶剂提取法高54.31%，且提取时间明显缩短，说明微波辅助提取法相比于传统的有机溶剂提取法更高效。在茼蒿叶黄酮提取研究中，张禄捷等[9]以微波辅助提取为基础的最佳工艺参数：发现以73 ℃微波温度，400 W的微波功率微波8 min，并在30∶1的料液比以及68%乙醇体积分数下提取效果最佳，总黄酮提取率为0.55%。总的来说，微波辅助提取法操作简单，均匀加热的特性不仅提高了效率还可有效保护其生物活性，在植物黄酮提取实验中有极大的可行性。

1.3 超声辅助提取法

超声辅助提取黄酮的主要机理是利用超声波产生的机械作用、热作用和空化作用，植物样品中产生强压和温度梯度，促使细胞结构破坏，细胞内黄酮类物质可自由流出，更易于将黄酮类物质从植物组织内部溶解出来[10]；因此，超声辅助提取法可增加植物黄酮运动的频率和速度，溶剂的渗透能力，及目标组分向溶剂中的渗透速率[11]。刘海鹏等[12]对银杏叶总黄酮物质提取工艺中，对比了乙醇回流提取法和超声辅助提取法的提取效果，发现超声提取法的黄酮提取率为96%，而乙醇回流法的提取率为89%。林继元等[13]使用超声辅助提取广西甜茶黄酮类物质时，确定最佳工艺为：30%乙醇浓度，料液比1∶30，提取温度40 ℃以及40 min提取时间，获得了3.85%的得率，相比传统回流法的约2.1%得率，提取效果显著。该方法获得极佳提取率的同时，节约了成本。与微波辅助提取法相比，超声波的能量属性可避免高温的影响，且由于其波动性质，可加速提取物的溶解[14]，因此超声提取法在植物黄酮分离提取研究中被广泛使用。

1.4 酶提法

酶法提取植物黄酮是一种新兴提取技术，其原理是利用酶解作用，对植物基质进行酶解，以完成对目标物质的提取。一般来说，酶法提取黄酮类化合物主要采用细胞壁降解酶如纤维素酶和果胶酶等来酶解植物细胞壁，使得细胞内的黄酮类化合物更易于溶解至溶剂[15]。与传统有机溶剂提取法相比，酶法提取黄酮类化合物的优势在于提取效率高、条件温和。段宙位等[16]对菠萝蜜果皮黄酮类物质提取工艺的研究中，分别使用有机溶剂提取法及酶法提取进行实验，并对比其黄酮得率，确定了酶法提取的最佳工艺为：选用浓度为30 U/g的果胶酶，时间2 h， 再经乙醇浓度为80%，料液比为1∶20，pH 5.5及提取温度为55 ℃，结果表明有机溶剂提取法黄酮总得率仅为3.05%，而酶法提取的总得率为4.98%，提取率提高1.94%。

1.5 半仿生提取法

半仿生提取法是张兆旺等根据“灰思维方式”提出的新提取方法，它是一种遵循人体胃肠环境特点的特殊提取工艺。它从生物药剂学的角度出发，将待提取液经过不同酸碱度的溶剂连续提取，模拟口服给药及药物经胃肠转运的过程，在提取液中加入人体消化系统内的多种消化酶，目的是使提取过程模拟待提取物在人体中的吸收过程，以便于更好的保留有效成分[17]。郭志红等[18]在玉米须总黄酮提取工艺的研究中，使用半仿生提取技术，并与有机溶剂提法进行比较，结果表明：半仿生醇提法黄酮提取量为15.59 mg/g，比传统有机溶剂提取法高59.4%。不仅效率更高，而且半仿生提取法不使用有机溶剂，萃取过程中不存在有机溶剂残留；但一直以来，此方法仍沿用高温煎煮的方式，可能会影响有效成分的活性；为了避免对热敏感的组分的损伤，有研究在接近人体温度下提取发现效果更佳[19]。

1.6 蒸汽爆破法

蒸汽爆破技术是一种预处理技术，目前对生物活性物质提取工艺的研究中是最有前景的预处理技术之一。其主要原理是将植物样品置于蒸气中并加压，保证反应时间，使得蒸汽可以渗入植物细胞中，然后通过瞬间降低气压，使热能转化成机械能，至细胞破裂，使提取物可与提取溶剂更充分接触，有利于进一步加工处理[20]。与传统的有机溶剂萃取法相比，蒸汽爆破技术可显著提高效率、缩短提取时间，更适用于工业规模的开发。与一些黄酮提取技术的替代工艺如超临界流体萃取、微波和超声波辅助萃取等相比，蒸汽爆破技术的主要优点是不需要使用有害的化学物质和溶剂，更利于环保[21]。Qin等[22]系统地研究了未经处理和蒸汽爆破处理对无花果叶总黄酮提取的影响，确定了蒸汽爆破处理的最佳工艺为：蒸汽压力0.2 MPa，处理时间3 min。并发现蒸汽爆炸预处理后，从无花果叶中提取的黄酮类化合物的产量比未经处理的无花果叶提高了55.9%。但是在较剧烈的蒸汽爆炸条件下(0.4 MPa,3 min)，黄酮类化合物的得率并没有提高，这可能是由于预处理温度较高时，黄酮类化合物受到了破坏。由此看出，适当强度的蒸汽爆破预处理对黄酮类化合物提取效果显著。

1.7 超临界CO2萃取法

超临界CO2萃取法的原理是在高压状态下使二氧化碳达到超临界，利用超临界CO2对黄酮类物质的特殊溶解作用将其溶解，再经过减压使CO2汽化，从而得到黄酮类物质，这种方法极大地解决了有机溶剂残留问题[23]。华燕青等[24]采用超临界CO2萃取法对薄荷总黄酮提取工艺进行了优化，优化工艺条件为：夹带剂乙醇浓度为70%，用量6 mL/g，萃取压力25 MPa，萃取温度55 ℃，萃取时间90 min，可获得3.72%的黄酮得率。总的来说超临界CO2萃取法有机溶剂用量少，节约了成本，黄酮得率相对较高，且CO2无毒且廉价，达到超临界态的温度较低，可以保证实验的安全性。但超临界CO2萃取法能耗高，设备要求高，自动化连续生产难，故多用于科学研究，不适于工业化大规模生产[25]。

1.8 亚临界流体萃取法

亚临界萃取法是植物黄酮分离提取研究中的新兴提取技术，原理是将提取剂加热至亚临界状态，即沸点之上但仍保持为液态的状态，改变溶剂分子的极性和表面张力，使一些原本难溶于溶剂的黄酮类物质溶解度显著增加，更利于提取分离[26]，该方法有提取速率快、设备容积大及节能等优点，广泛应用于工业化生产[27]。

亚临界流体萃取溶剂类型有水及有机溶剂等，其中亚临界水萃取法是研究热点之一，水是一种易得、无毒且环境友好型溶剂，亚临界水对于植物黄酮的萃取有提取效率高、环境友好等优点[28]。高如意等[29]使用亚临界水萃取法，对油菜花粉中黄酮类物质进行分离提取，优化了提取工艺，效果显著。但亚临界水萃取法的不足之处在于：为了达到实验目的需要很高的温度才能使水达到亚临界，这很有可能会破坏黄酮类物质的生物活性[30]。选用有机溶剂作为萃取剂很好的避免了亚临界水萃取的不足，并由于蒸发分离的缘故，有机溶剂可重复使用，有利于环保。李禹辰等[27]实验中使用有机溶剂丙酮作为萃取剂，采用单因素实验优化了提取工艺，其总黄酮得率为15.03%。

2 黄酮类化合物分离纯化方法

黄酮类化合物的分离纯化方法主要包括柱层析色谱法和膜分离法等，见表2。

表2 黄酮类化合物分离纯化方法比较Table 2 Comparison of separation and purification methods of flavonoids

2.1 柱层析色谱法

聚酰胺、硅胶及葡萄糖凝胶柱色谱法在植物活性物质的分离纯化中应用广泛，同样也适用于植物黄酮的分离纯化。

2.1.1 硅胶柱色谱法 硅胶是一种极性吸附剂，为多孔性物质，其吸附作用机理与硅醇基含量有关，其吸附能力随硅醇基吸水量的增加而降低。但硅胶对黄酮类物质有很强的吸附能力，且硅胶内含有的金属离子极易与黄酮类物质络合而难被洗脱，因此在硅胶预处理中应使用浓盐酸充分清洗，以去除金属离子对实验的干扰[31]。唐少华等[32]对大豆黄酮分离的研究中，使用硅胶柱层析法分离得到的产物纯度达到90%以上。但是，传统硅胶柱层析法耗时间、耗溶剂，且容易产生死吸附。近年来，为了进一步提高分离效率，闪式硅胶柱色谱法被广泛关注，使用闪式硅胶柱可显著缩短上样时间，减少死吸附，与传统硅胶相比极大的提高了效率和产品纯度。王雯丽等[33]使用闪式硅胶柱色谱法纯化厚朴总酚，确定了最佳工艺为：使用10倍量的硅胶装柱，洗脱溶剂选用石油醚-醋酸乙酯(10∶1～10∶3)进行梯度洗脱，洗脱速率5 mL/min，并与传统硅胶提取工艺进行比较，发现闪式硅胶柱色谱法纯化质量分数为60%的乙醇提取液，所得厚朴总酚质量分数>99.5%，相对于传统硅胶柱层析分离的98%的总酚质量分数，提高了1.5%。

2.1.2 葡聚糖凝胶柱色谱法 葡聚糖凝胶是一种新型吸附剂，对多种生物活性物质有很好的吸附效果，最常用到的是羟丙基葡聚糖凝胶Sephadex LH-20，该型凝胶纯化效率高、杂质少且可多次循环使用[34]。研究表明葡聚糖凝胶对游离黄酮中的酚羟基有吸附作用，游离黄酮中的酚羟基越多则吸附力越强，洗脱时在凝胶柱上滞留时间越长，可用于不同种类黄酮的分离制备；但过多酚羟基的黄酮类物质由于吸附作用过强，导致洗脱难度较大，难以进行进一步分离纯化[35-36]。而对黄酮甙，葡聚糖凝胶则主要起分子筛的作用；因为葡聚糖凝胶在溶剂中成三维网状结构，可使小分子渗入，大分子则随溶剂先行流出，而流入葡聚糖凝胶内部的小分子则以分子量由大到小先后流出，从而达到分离的目的。姚开等[37]在大豆异黄酮主要单体成分分离的研究中，采用Sephadex LH-20凝胶柱进行实验，以90%甲醇作为洗脱剂、按2.0 mL/min流速洗脱，分别获得纯度为95.7%和95.1%的染料木苷和大豆苷。可见葡聚糖凝胶柱色谱法纯化黄酮类物质可获得极高的纯度。

2.1.3 聚酰胺柱色谱法 聚酰胺柱色谱法分离植物黄酮是利用黄酮类物质中的酚羟基与聚酰胺分子中游离胺基与醌类等作用形成氢键，达到吸附作用，再经洗脱得到纯度较高的植物黄酮[38]。聚酰胺柱色谱法具有高效、分离效果好等优势，并且聚酰胺树脂由于其不残留有毒的有机溶剂及重金属物质，适用于工业化生产。王克勤等[39]在芹菜黄酮分离纯化研究中，用聚酰胺吸附法纯化黄酮含量19.14%的粗提液，纯化后的溶液黄酮纯度高达80%，纯化效果极佳。冯爱博等[40]对竹笋壳黄酮类物质的纯化实验中，对比聚酰胺和大孔树脂两种材料的纯化效果，发现使用聚酰胺吸附法所得总黄酮得率略高，证明聚酰胺对黄酮类物质的选择性更佳。但聚酰胺材料的死吸附较大，使已吸附黄酮类物质不能充分洗脱，有时会导致损失量较大；因此，在上样量较少时应谨慎使用。

2.1.4 大孔树脂柱色谱法 大孔树脂是一种有机高分子聚合物，其吸附原理是利用分子间的范德华力，通过巨大的比表面从溶剂中吸附黄酮类物质，再经洗脱得到纯度较高的黄酮类物质。大孔树脂柱色谱法因具有选择性好、吸附量大和节约成本等优点，适用于大规模生产，在植物黄酮提取液的纯化中备受青睐[41]。冯靖等[42]用DPH-100型号大孔树脂对黄酮粗提液进行纯化时，纯化前提取液浓度为25%，在最佳工艺条件下，纯化后浓度达到了74%，且树脂可重复使用6次。但疏水性较强的大孔树脂具有较多的非特异性吸附，导致产物纯度较低。为解决此问题，王芃等[43]制备了以丙烯酸甲酯(MA)-二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)共聚的酰胺基化合成树脂(MA-EGDMA)，显著降低了树脂的非特异性吸附，纯化后的黄酮质量分数提高了30%。因此，合成树脂法显著改善了大孔树脂吸附法产物纯度较低的不足，值得深入探讨。

2.2 膜分离法

膜分离法即用膜实现不同物质分离的方法，其原理是利用膜的选择性渗透作用，将提取液流过膜，通过外界压力、浓度及电势差等作用下，使只有分子量小于膜孔径物质的通过膜，从而达到物质的分离纯化目的[44]。根据孔径大小膜分离法中使用的膜可分为微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜等。其中超滤法最具代表性，该法不需要经过相变或加辅助剂，仅通过控制膜的孔径来提取目标物质，十分节能环保。此法工艺简单、且纯化效果好，在植物黄酮分离提取工艺研究中潜力巨大，但该法不适用于分子量相差不大的黄酮类化合物的分离纯化，且膜的渗透性会随时间而降低，降低膜的分离性能[45]。孙晓春等[46]在桔梗总黄酮分离研究中发现，经0.2 μm孔径的膜纯化后，不仅黄酮提取率高达66.58%，且对·OH 和DPPH·的清除率分别高达68.42%和90.50%。

3 展望

目前植物中黄酮类物质的分离提取工艺已经相当成熟，但仍存在选择性差，污染环境，工业应用成本高等缺点。在今后的研究过程中，应向着更低成本，更适用于大规模生产及更高选择性等方向发展。一方面对传统工艺进行优化；一方面开发新的方法。比如：通过改造设备提高性能来优化工艺，增加有机溶剂的回收装置以及尽可能的将设备功能最大化利用等；尝试将现有的提取工艺与高新技术相结合，可以以几种分离提取方式为基础，建立一种连续的分离提取设备、让提取过程更加高效、安全、无污染，使得黄酮这一优质天然的资源获得更广泛的利用。本文综述的内容，以期为植物中黄酮类物质的提取和分离纯化提供参考。